蛛網(wǎng)膜下腔出血后內(nèi)皮素受體（ETA／ ETB） 不平衡表達在大鼠基底動脈痙攣中的作用

孫雷濤，宋錦寧，杜洪澎，王曉紅，李 勐，李澤福

（1．濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科、實驗中心，山東濱州 256600；2．西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061）

遲 發(fā) 性 腦 血 管 痙 攣 （delayed cerebral vasospasm，DCVS）由ECKER首次提出以來，DCVS引起的缺血性腦損傷是影響SAH患者預(yù)后的主要因素之一［1-2］。目前，大量研究表明，DCVS與內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）有 關(guān)［3-4］。ET-1 通 過 ETA／ETB兩種不同受體動態(tài)地調(diào)節(jié)著血管緊張度［5］。本研究通過建立SAH后腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）模型，動態(tài)觀察了ETA／ETB兩種不同受體與CVS發(fā)生的關(guān)系，旨在闡明內(nèi)皮素受體不平衡表達在CVS中的作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠60只（西安交通大學實驗動物中心），體質(zhì)量240～260g，在標準環(huán)境飼養(yǎng)，室溫（24±2）℃，24h晝夜循環(huán)光照，術(shù)前術(shù)后自由攝食飲水。動物隨機分為SAH模型組、鹽水對照組、假手術(shù)對照組（6只）、正常對照組（6只）。SAH模型組、鹽水對照組根據(jù)建立模型后的不同時間段分為4個亞組，分別是：建模后的2d組、3d組、7d組和14d組。每個亞組6只動物。

1．2 大鼠SAH模型制作及標本取材 大鼠自體血二次注入枕大池SAH模型制作參照PRUNELL等［6］實驗方法，應(yīng)用100g／L水合氯醛（3．5mL／kg）腹腔麻醉后取俯臥頭低位，在手術(shù)顯微鏡下暴露寰枕筋膜，尾動脈取血0．4mL，用4號頭皮針緩慢進針刺破寰枕筋膜，至清亮腦脊液（CSF）流出，將未抗凝自體血0．3mL緩慢注入（用時20min）枕大池，注射后穿刺點壓迫5min，耳腦膠封閉穿刺點并保持頭低位30min以上。48h后依上法二次操作，建立SAH的DCVS模型。正常對照組不進行任何手術(shù)操作。鹽水對照組建立方法同SAH組，但注入等量的37℃生理鹽水。穿刺對照組僅行枕大池穿刺并見到CSF流出，48h后進行第二次穿刺。時間按第2次注血造模成功后開始計算。

各組動物達到預(yù)定時間后取材，動物麻醉后，37℃、250mL的生理鹽水重力作用下沿大鼠體循環(huán)快速灌注，而后用40g／L多聚甲醛溶液400mL進行免疫熒光行灌注固定。迅速斷頭取腦，在橋腦中央處橫斷，取保留基底動脈上段的腦片。行常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后冠狀切片，片厚約7μm，每個標本常規(guī)切7層，兩層用于染色，剩余應(yīng)用于血管截面積計算。

1．3 形態(tài)學觀察 切片在常規(guī)HE染色后，在光學顯微鏡下觀察基底動脈形態(tài)學變化，并應(yīng)用圖像采集與分析系統(tǒng)（Q550W，Leica公司，德國）收集數(shù)據(jù)。計算每只動物基底動脈3層切片截面積，求均值。

1．4 免疫熒光染色 應(yīng)用兔抗鼠ETA／ETB受體（ETAR／ETBR）單克隆一抗及羊抗兔熒光二抗（博士德公司）行免疫熒光染色。切片置于OLYMPUS（IX71-A21PH，日本）熒光顯微鏡400倍下照相并應(yīng)用Image-ProPlus圖像分析軟件進行轉(zhuǎn)化灰度分析。

1．5 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。先行方差齊性檢驗，方差齊的指標采用One-way ANOVA檢驗的方差分析，并行LSD法進行組間兩兩比較，方差不齊的指標則用Kruskal-Wallis法行秩和檢驗。計量資料的結(jié)果采用Mean＋SEM表示，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2．1 基底動脈的形態(tài)學觀察結(jié)果 SAH實驗組造模后2d血管內(nèi)皮細胞即出現(xiàn)褶皺，血管平滑肌收縮，血管平滑肌層厚度增大，基底動脈截面積較鹽水對照組出現(xiàn)顯著下降（P＜0．05），3d時狹窄到達最高峰，在7d以后直到14d時血管直徑逐漸恢復正常。在注血手術(shù)后，大鼠基底動脈出現(xiàn)了明顯規(guī)律性腦血管收縮（圖1）。

圖1 大鼠造模后基底動脈面積的動態(tài)變化Fig．1 Dynamic changes of the area of the basilar artery after CVS

2．2 SAH后基底動脈ETA／ETB受體免疫熒光染色及半定量分析 免疫熒光染色結(jié)果顯示，正常、假手術(shù)組、鹽水對照組可見ETA／ETB受體蛋白較弱表達。SAH后2d基底動脈ETA受體已有增強，3d達高峰，此后逐漸減弱，主要集中在血管內(nèi)皮層；而ETBR在7d達高峰，此后熒光強度逐漸減弱，3d時在內(nèi)皮細胞層熒光強度升高表現(xiàn)的更加明顯，而7、14d時血管平滑肌中熒光強度升高較明顯（圖2）。熒光灰度分析顯示總熒光強度ETAR最高峰出現(xiàn)在第3天，而ETBR出現(xiàn)在第7天。SAH后2、3、7、14d時ET受體表達與正常對照組相應(yīng)時間點比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。ETB受體在SAH實驗組中2～3d時在內(nèi)皮細胞層中表達增強更明顯，而在7d時平滑肌細胞層中的表達增強更明顯（圖3）。

圖2 大鼠基底動脈ET受體免疫熒光染色結(jié)果Fig．2 Immunofluorescence staining results of ET receptor in the rat basilar artery

圖3 大鼠基底動脈內(nèi)皮細胞層與平滑肌細胞層中ETBR受體免疫熒光灰度值的表達變化Fig．3 Changes of immunofluorescence gray value of ETBR in the endothelial and smooth muscle cells of rat basilar artery

3 討 論

30年來對DCVS的研究，比較公認可能是多種因素共同作用的結(jié)果，血管舒縮因子的不平衡在其中起重要作用［7-8］。ET-1與ETA受體結(jié)合后會激活磷脂酶C，進而使Ca2＋內(nèi)流和PKC激活，此時磷脂酶A2和D也被激活使甘油二脂（DAG）持續(xù)升高，后者又是PKC的內(nèi)源性激動劑。與存在于血管內(nèi)皮細胞的ETB1受體結(jié)合，發(fā)揮血管依賴性松弛作用，而與存在于血管平滑肌細胞的ETB2受體結(jié)合，發(fā)揮與ETA受體相同的縮血管效應(yīng)。但對于ET-1的血管收縮信號機制仍不十分清楚［9］。

本研究在公認的Delgado法大鼠枕大池穿刺二次注血法建立大鼠的CVS模型基礎(chǔ)上，改進傳統(tǒng)的股動脈或股靜脈血注入。選用大鼠尾動脈血注入，以最大限度減少手術(shù)并發(fā)癥及動物死亡率［10-11］。從基底動脈形態(tài)學觀察可以看出造模后在3～7d時發(fā)生了明顯的血管痙攣，與臨床發(fā)生DCVS的時程一致。此方法可以定量、定時、定部位的注血并良好模擬了DCVS的病理過程。同時，本研究中取材采用了37℃生理鹽水心臟灌注及快速取腦液氮保存的方法，使得腦灌注壓盡量保持與正常血壓一致，而且很好阻滯了腦血管發(fā)生快速血壓調(diào)節(jié)引起的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)換。但是，目前的實驗技術(shù)及生化試劑限制，仍存在不能很好區(qū)分ETB受體的亞型表達改變、表達部位的準確定位、很難對表達蛋白進行定量檢測等問題。

本實驗結(jié)果顯示大鼠SAH后DCVS模型中基底動脈內(nèi)皮細胞中ETA／ETB受體均有表達升高，而更為重要的是在SAH后7d時血管平滑肌中ETB受體的表達達到高峰。分析其原因可能與SAH后CVS的緩解有關(guān)，而內(nèi)皮細胞的ETB受體短暫表達上調(diào)，可能與ETA受體共同參與了DCVS的過程。HANSEN等［12］研究發(fā)現(xiàn)SAH后大腦中動脈、基底動脈ETB受體表達升高而ETA受體沒有變化，后交通動脈兩者均無變化。而ANSAR等［13］研究了不同血管對ET-1反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)在離體培養(yǎng)條件下僅有ETB受體的表達上調(diào)。而也有類似研究發(fā)現(xiàn)DCVS時ETB受體的表達下調(diào)，并提出應(yīng)用ETB受體阻滯劑不能很好緩解腦血管收縮［14-15］。分析這種ET受體表達的不同結(jié)果，我們認為可能是由于離體條件下血管灌注壓的瞬時改變，引起了血管收縮性受體的表達調(diào)節(jié)變化以及與腦血管取材方法、取材時間有關(guān)。因此，對于ET受體表達的研究應(yīng)該更加注重體內(nèi)研究以及取材前的腦灌注壓維持。本實驗結(jié)果顯示，SAH后3～7d時發(fā)生了明顯基底動脈的血管收縮；ET受體的蛋白及mRNA水平的表達表現(xiàn)一致。內(nèi)皮細胞中ETA受體與ETB受體3d時表達顯著升高可能參與了DCVS的發(fā)生，而血管平滑肌中ETB受體7d時的表達升高，可能與7d后DCVS的緩解有關(guān)聯(lián)；ETB受體兩種亞型的差異性表達可能是DCVS中的原因。

ET-1在DCVS的作用機制復雜。本研究結(jié)果表明兩種ETA／ETB受體的差異性表達在SAH后CVS中起重要作用。ETB受體亞型在腦血管各層中具體表達差異有待進一步研究。但本研究結(jié)果提示，深入研究CVS中ET受體下游調(diào)控的具體分子機制和有關(guān)下游各種蛋白激酶表達變化，及其與ET受體表達上調(diào)的關(guān)系，可以采用活體免疫熒光自顯影、基因干擾或敲除、高特異性單克隆抗體等蛋白工程與基因工程技術(shù)進一步探討。

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