褐藻多糖硫酸酯與山楂提取物混合劑的降血脂作用

王亞芳，汪秋寬，何云海，任丹丹，林茹，宋悅凡，叢海花

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗室，遼寧大連116023)

心腦血管疾病嚴(yán)重危害人類健康，而脂質(zhì)代謝與心腦血管疾病密切相關(guān)，脂質(zhì)代謝紊亂所致的動脈粥樣硬化是引起心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素［1］。不僅如此，血脂濃度升高還會增加心腦血管疾病患者的死亡率，因此，如何通過飲食調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生，已成為科研工作者研究的熱點(diǎn)［2-4］。

厚葉海帶是一種4～5年生亞寒帶可食用藻類，也是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價值的巨型海藻，厚葉海帶含有優(yōu)質(zhì)的褐藻多糖硫酸酯，含量比其他藻類要多［5］。裙帶菜隸屬于褐藻門、褐藻綱、海帶目、翅藻科、裙帶菜屬，其中裙帶菜孢子葉含有豐富的蛋白質(zhì)與多糖［6］。褐藻多糖硫酸酯是一種水溶性雜聚糖，是褐藻和一些海洋無脊椎動物的組成成分［7］，主要是以L-巖藻糖和硫酸根組成，還伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和鉀、鈉、鈣等金屬離子［8］。已有研究表明，褐藻多糖硫酸酯具有抗氧化、降血脂等多種生物活性［9-13］。而山楂營養(yǎng)豐富，具有豐富的小分子酸和糖等物質(zhì)，自身具有降血脂作用［14］。本研究中，用不同劑量的山楂提取物與褐藻多糖硫酸酯配伍的混合劑，灌胃高脂大鼠，并對其血清及肝臟組織各項指標(biāo)進(jìn)行測定，分析了其混合劑的降血脂作用。

1 材料與方法

1.1 材料

日本厚葉海帶、裙帶菜孢子葉褐藻多糖硫酸酯及山楂提取物由大連海洋大學(xué)國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心提供。

試驗動物為清潔級Wistar大鼠，共56只，體質(zhì)量為150～170 g，由大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗動物中心提供。

試驗試劑:L-巖藻糖、D-半乳糖、苯酚、濃硫酸、濃鹽酸、氨水、硫酸鉀、山梨醇、氯化鋇均為市售分析純;豬膽鹽、膽固醇、豬油、脂必妥均為市售食用級的;總膽固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白 (LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)、一氧化氮 (NO)測定試劑盒與蛋白定量測定試劑盒均購自南京建成生物工程公司。

主要儀器及設(shè)備:721型可見分光光度計 (上海光譜儀器有限公司)、HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、高速多功能粉碎機(jī) (永康市綠可食品機(jī)械有限公司)、iMark酶標(biāo)儀 (Bio-RAD)、LD5-2A低速離心機(jī) (北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 方法

1．2．1 褐藻多糖硫酸酯組分含量的測定

(1)總糖含量。采用苯酚硫酸法［15］，準(zhǔn)確稱取21 mg(L-巖藻糖∶D-半乳糖=3∶1)，用去離子水溶解并定容至500 mL。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4、1．6、1．8 mL 加入到9個25 mL的比色管中，向9個比色管中分別加入 2．0、1．6、1．4、1．2、1．0、0．8、0．6、0．4、0．2 mL去離子水，然后加入6%苯酚溶液各1 mL，最后加入濃H2SO4各5 mL。搖勻后靜置，冷卻至室溫后在490 nm處測其吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別稱取0．01 g日本厚葉海帶、裙帶菜孢子葉褐藻多糖硫酸酯樣品，溶解并定容至100 mL，吸取配好的樣液1．0 mL，按照上述步驟，測定其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算得出樣品的總糖含量。

(2)硫酸根含量。采用明膠BaCl2法［16］，稱取兩種褐藻多糖硫酸酯樣品0．1 g，分別放入25 mL的比色管中，加入2 mol/L鹽酸10 mL，然后將其置于室溫下過夜，封管后放入105～110℃的烘箱中恒溫水解5 h，取出，冷卻至室溫。用2 g顆?；钚蕴棵撋儆脼V紙過濾，水洗，將濾液和洗滌液合并，用5 mol/L NH4OH中和至pH值為6～7，移入50 mL容量瓶中并定容至刻度，待用。

分別吸取 0、0．1、0．3、0．5、0．7、0．9 mL 0．05%K2SO4溶液以及0．5 mL樣品稀釋液于比色管中，各以水補(bǔ)至4 mL，依次加入體積分?jǐn)?shù)為50%的鹽酸0．8 mL、70%的山梨醇溶液4 mL和200 g/L氯化鋇溶液4 mL，混合均勻后放置10 min，于470 nm處比濁得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的硫酸根含量。

1．2．2 混合劑的降血脂作用

(1)高脂飼料的制作。基礎(chǔ)飼料由大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗動物中心提供。將膽固醇與豬膽鹽按比例充分混勻，加入到基礎(chǔ)飼料中，然后放入適量的蒸餾水用斬拌機(jī)不斷攪拌，再加入融化后的豬油并充分混勻，制成含10%豬油、2%膽固醇、0．5%豬膽鹽的高脂飼料，風(fēng)干處理后備用。

(2)試驗設(shè)計。將Wistar大鼠 (150～170 g)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為7組，每組為8只，每日灌胃，飼養(yǎng)方式如表1，試驗周期為28 d，試驗期間自由取水取食。

厚葉混合劑為日本厚葉海帶褐藻多糖硫酸酯與山楂提取物 (比例1∶1)。裙帶菜混合劑為裙帶菜孢子葉褐藻多糖硫酸酯與山楂提取物 (比例1∶1)。

表1 大鼠的分組Tab.1 Groups of mice

(3)指標(biāo)的測定。末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h后，稱重，用乙醚麻醉，將已麻醉的大鼠固定，從腹主動脈取血，以3000 r/min離心15 min，得上清液，用試劑盒測定血清 TC、TG、LDL-C、HDL-C含量;同時取肝臟、脾臟組織，計算其臟器指數(shù);取肝臟的相同部位約0．3 g，放入冰冷的生理鹽水中勻漿，制成10%肝組織勻漿液，用試劑盒測定GSH-Px、SOD活性、MDA和NO含量。通過下式計算:

動脈粥樣硬化指數(shù) (AI)=TC/HDL-C，

肝臟指數(shù) (mg/g)=小鼠肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量，

脾臟指數(shù) (mg/g)=小鼠脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excell將試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重檢驗，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻多糖硫酸酯的各組分含量

從表2可見，日本厚葉海帶與裙帶菜孢子葉中的糖含量相近，而日本厚葉海帶中的硫酸根含量較裙帶菜孢子葉高。

2.2 混合劑對大鼠體質(zhì)量的影響

從表3可見:與空白對照組相比，高脂模型對照組大鼠的體質(zhì)量均有升高，僅第一周時有顯著性升高 (P＜0．05)，其余時間點(diǎn)均未出現(xiàn)顯著性差異 (P＞0．05);與高脂模型對照組相比，第28天時，僅厚葉混合劑高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P＜0．05)，裙帶菜混合劑高劑量組大鼠體質(zhì)量極顯著降低 (P＜0．01)。

表2 褐藻多糖硫酸酯各組分含量Tab.2 Contents of the components in seaweed fucoidan

2.3 混合劑對大鼠血清 TC、TG、LDL－C、HDL－C含量的影響

從表4可見:與空白對照組相比，高脂模型對照組TC、LDL-C含量極顯著升高 (P＜0．01)，TG含量顯著升高 (P＜0．05)，HDL-C含量有所降低，但無顯著性差異 (P＞0．05);灌胃混合劑之后，與高脂模型對照組相比，厚葉混合劑和裙帶菜混合劑各劑量組大鼠的TC、LDL-C含量均極顯著降低 (P＜0．01)，TG含量顯著降低 (P＜0．05)，而HDL-C含量有所升高，但無顯著性差異 (P ＞0．05)。

表3 混合劑對大鼠體質(zhì)量的影響 (n=10)Tab.3 Effects of the mixture on body weight of mice(n=10)

表4 混合劑對大鼠血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白含量的影響 (n=10)Tab.4 Effects of mixture on serum of levels TC，TG，LDL－C and HDL－C in mice(n=10) mmol/L

2.4 混合劑對大鼠血清中AI值以及臟器指數(shù)的影響

從表5可見:與空白對照組相比，高脂模型對照組AI值極顯著升高 (P＜0．01)，臟器指數(shù)無顯著性變化 (P＞0．05);與高脂模型對照組相比，厚葉混合劑與裙帶菜混合劑各劑量組大鼠AI值均極顯著降低 (P＜0．01);僅裙帶菜混合劑低劑量組肝臟指數(shù)顯著降低 (P＜0．05)，其余各組臟器指數(shù)均無顯著性變化 (P＞0．05)。

2.5 混合劑對大鼠肝組織中MDA、NO含量和SOD、GSH－Px活性的影響

從表6可見:與空白對照組相比，高脂模型對照組的MDA含量極顯著升高 (P＜0．01)，SOD活性、NO含量極顯著降低 (P＜0．01);與高脂模型對照組相比，各混合劑組MDA含量均有所降低，SOD活性有所升高，但均未表現(xiàn)出顯著性變化(P＞0．05)，GSH-PX活性極顯著升高 (P＜0．01)，僅厚葉混合劑低劑量組NO含量顯著升高(P ＜0．05)。

表5 混合劑對大鼠血清AI值及臟器指數(shù)的影響 (n=10)Tab.5 Effects of the mixture on serum AI，and liver and spleen indices of mice(n=10)

3 討論

高脂血癥包括高膽固醇血癥、高甘油三脂血癥和復(fù)合性高脂血癥。已有研究表明，血清中TC、TG濃度的異常增加與心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險呈正相關(guān)，血清中的TC主要存在于LDL-C中，當(dāng)LDL-C含量升高時，動脈內(nèi)膜產(chǎn)生氧自由基聚集及其他代謝產(chǎn)物，使進(jìn)入內(nèi)皮的LDL氧化修飾，成為氧化型的低密度脂蛋白 (ox-LDL)，ox-LDL作為啟動分子，在動脈粥樣硬化 (AS)發(fā)生的早期起了關(guān)鍵作用［2］。而HDL-C可作為逆向轉(zhuǎn)運(yùn)TC的載體，其濃度增加可加快血液中TC的分解［17］。本試驗結(jié)果表明:厚葉混合劑和裙帶菜混合劑均能有效改善高脂模型組大鼠的血脂水平，減少血清TC蓄積，顯著降低TG含量，極顯著降低LDL-C含量和AI值。以上數(shù)據(jù)分析顯示，厚葉混合劑與裙帶菜混合劑均具有不同程度的分解TC的能力，減少TC在肝臟中的積累，進(jìn)而達(dá)到降血脂的目的。諶素華等［13］研究表明，馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯可降低高血脂小鼠血清的TC、TG、LDL-C含量，提高HDL-C含量，同時對其動脈粥樣硬化指數(shù) (AI)有極顯著的影響。Zhu等［14］研究表明，山楂中的提取物可降低血清TC、TG、LDL-C含量，降低肝臟TC含量，同時下調(diào)HMGCR、ACAT的酶活和基因表達(dá)，上調(diào)CYP7A1的酶活與基因表達(dá)。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，提示混合劑能顯著調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝，有效預(yù)防高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化的形成，但對其降血脂機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

表6 混合劑對大鼠肝臟組織MDA、NO含量和SOD、GSH－Px活性的影響 (n=10)Tab.6 Effects of the mixture on heptic MDA，NO content，SOD and GSH －Px activety in mice(n=10)

此外，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，是反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平的重要指標(biāo)。SOD是清除氧自由基的主要酶系，GSH-PX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解酶，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，SOD和GSH-Px活力的高低反映了機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱［18］。高膽固醇血癥狀態(tài)下，SOD和GSH-Px活力降低，清除自由基能力減弱，則脂質(zhì)過氧化程度進(jìn)一步加強(qiáng)。所以高膽固醇血癥狀態(tài)下，脂質(zhì)水平升高，抗氧化能力下降，表現(xiàn)為嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化及動脈粥樣硬化 (AS)發(fā)生的高危險性［19］。本試驗結(jié)果顯示:裙帶菜混合劑高劑量能降低大鼠體內(nèi)的MDA含量，升高SOD水平，但效果不明顯;而厚葉混合劑與裙帶菜混合劑各劑量均能顯著提高大鼠血清GSH-PX活力，具有一定的抗氧化活性。王靜鳳等［20］研究了兩種海參對高脂大鼠的治療效果，結(jié)果表明，菲律賓刺參和日本刺參均能明顯降低高脂血癥大鼠血清TC、LDL-C含量和LDL-C/HDLC值，提高HDL-C及NO含量，同時顯著降低血清和肝臟中MDA含量，并提高其SOD和GSH-Px活性。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，厚葉混合劑與裙帶菜混合劑能夠通過提高機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶的活性，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，起到抗動脈粥樣硬化的作用。

綜上所述，本試驗條件下，混合劑的劑量對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)無明顯差異，說明用混合劑灌胃大鼠均具有較好的降血脂功效，在對降血脂功效進(jìn)行深入研究時，可采用更低劑量的混合劑。

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