赤小豆萌芽最佳抗敏天數(shù)及相關(guān)活性物質(zhì)研究

李 麗,任晗堃,董銀卯,宋麗雅,張小慧,劉 暢

(北京市植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京工商大學(xué),北京 100048)

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赤小豆萌芽最佳抗敏天數(shù)及相關(guān)活性物質(zhì)研究

李 麗,任晗堃,董銀卯*,宋麗雅,張小慧,劉 暢

(北京市植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京工商大學(xué),北京 100048)

通過(guò)透明質(zhì)酸酶體外抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同萌芽天數(shù)(0～6d)赤小豆抗敏活性,同時(shí)測(cè)定不同萌芽天數(shù)(0～6d)赤小豆中總皂苷、總多酚及總多糖含量,并與透明質(zhì)酸酶抑制活性進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明:赤小豆萌芽第4d抗敏效果最佳,各成分在萌芽過(guò)程中的變化不同,結(jié)合萌芽過(guò)程中多酚、多糖和皂苷類成分總含量的變化,確定多酚類物質(zhì)是赤小豆萌芽中的主要抗敏活性物質(zhì)。

赤小豆,萌芽,抗敏,活性成分

赤小豆(Vignaumbellata),別名紅小豆,先載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其與赤豆(P.angularis)的外形和習(xí)性都很相似,不易區(qū)分,但赤小豆種子呈圓柱形而稍扁,兩端較平,長(zhǎng)5～8mm,表面暗紅色或紫紅色,平滑微有光澤[1]。赤小豆在我國(guó)資源分布廣泛,主產(chǎn)于我國(guó)浙江、江西、湖南、廣東、廣西等南部各省[2]。自古以來(lái),因其良好的清熱利濕、解表散邪功效,在治療水腫、腳氣、黃疸、瀉痢、便血、癰腫等癥時(shí),發(fā)揮重要作用[3],現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,其具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、保肝及抗腫瘤的作用[4-9]。

國(guó)內(nèi)外已有研究證明大豆、綠豆、赤豆、蕎麥等多種谷物具有重要的抗敏功效,為抗敏食品的重要來(lái)源。紅小豆乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位可以完全抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO產(chǎn)生,iNOS和COX-2表達(dá),TNF-α和IL-6的釋放,并通過(guò)下調(diào)ERK/p38-和NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抗敏活性,其發(fā)揮抗敏活性的主要物質(zhì)為兒茶素7-O-β-D-葡萄糖苷為主的多酚類成分[14]。種子萌芽是天然的激發(fā)過(guò)程,隨著萌芽過(guò)程酶活性提高,活性物質(zhì)增加,新陳代謝水平提高,使得包括多酚在內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物大量生成,從而提高植物本身的藥理活性。

赤小豆中主要含有酚類、五環(huán)三萜、皂苷、黃酮、鞣質(zhì)等活性成分,但目前尚未有研究赤小豆萌芽過(guò)程中抗敏活性變化及相關(guān)成分分析的報(bào)道,本文通過(guò)透明質(zhì)酸酶抑制實(shí)驗(yàn)篩選赤小豆具有最佳抗敏活性的萌芽天數(shù),通過(guò)對(duì)萌芽過(guò)程中總皂苷、總多酚及總多糖含量變化的測(cè)定及與抗敏活性的相關(guān)性分析,總結(jié)赤小豆萌芽中發(fā)揮抗敏活性的主要成分。

表1 透明質(zhì)酸酶實(shí)驗(yàn)步驟Table1 The steps of hyaluronidase experiment

注:“+”為此項(xiàng)添加,“-”為此項(xiàng)不添加。1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤小豆(種子) 購(gòu)于北京市永輝超市,原產(chǎn)地吉林；透明質(zhì)酸酶 Sigma公司；透明質(zhì)酸鈉(Solarbio)及乙酰丙酮、沒(méi)食子酸、葡萄糖、齊墩果酸、香草醛、甘草酸二鉀對(duì)照品 均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、乙醇、甲醇、苯酚、高氯酸、冰醋酸 北京化工廠；鹽酸 北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；碳酸鈉 西隴化工股份有限公司；Folin-Ciocalteu試劑 北京索萊寶科技有限公司上述試劑均為分析純。

CQ-250超聲波清洗器 上海超聲波儀器廠；JA5003電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀 Thermo Science；HH·S21-8電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；SIGMA 4K15離心機(jī) 北京博勱行儀器有限公司；GX-04粉碎機(jī) 上海高翔食品機(jī)械廠；DS63295,DU34526移液槍 北京DRAGON LAB。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 萌芽樣品的制備 選籽粒飽滿、無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉?fàn)€、無(wú)殘破的赤小豆,每10g赤小豆種子為1個(gè)實(shí)驗(yàn)組,進(jìn)行萌芽,重復(fù)3次,按照最佳抗敏萌芽工藝萌芽0～6d,每天取出1個(gè)實(shí)驗(yàn)組赤小豆芽于干燥箱,50℃干燥24h,取出后,粉碎機(jī)粉碎,過(guò)80目篩,裝入塑封袋,4℃保存待用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用該方法進(jìn)行萌芽材料制備。

1.2.2 透明質(zhì)酸酶抑制實(shí)驗(yàn) 精密稱取赤小豆粉末1.0g,分別加入75%甲醇10mL,室溫下超聲提取30min,功率為100W。離心后,取上清液用緩沖液稀釋后待下一步實(shí)驗(yàn)用。根據(jù)Elson-Morgan法[10],對(duì)樣品進(jìn)行抗敏活性的測(cè)定,每個(gè)樣品三組平行,1%甘草酸二鉀作為陽(yáng)性對(duì)照。具體實(shí)驗(yàn)步驟如表1所示。

式中:A-對(duì)照溶液OD值(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液)；B-對(duì)照空白溶液OD值(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液及酶液)；C-試樣溶液OD值；D-試樣空白溶液OD值(用醋酸緩沖溶液代替酶液)。

1.2.3 總多酚含量測(cè)定 參照Taga等[11]方法進(jìn)行改進(jìn)。

1.2.3.1 對(duì)照品與供試品溶液的制備 對(duì)照品溶液精密稱取0.10g沒(méi)食子酸,用蒸餾水溶解、定容至100mL,此溶液質(zhì)量濃度為1.0mg/mL。分別吸取上述溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL至10mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,所得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL。供試品溶液精密稱取萌芽0～6d赤小豆粉末各1.0g于試管中,加入75%甲醇10mL,超聲提取30min,以12000r/min離心5min,取上清液,待測(cè)。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取不同濃度100μL沒(méi)食子酸對(duì)照品于試管中,加入100μL甲醇和0.3%鹽酸(體積之比為6∶4),加入2%的碳酸鈉溶液2.0mL,混勻。靜止2min加入50%的Folin-Ciocalteu試劑100μL,暗處理30min,分別測(cè)定在750nm下的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 總多酚含量的測(cè)定 取100μL樣液于試管中,按上述步驟操作,分別在750nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總多酚含量。

1.2.4 總多糖含量測(cè)定 參照孫麗麗[12]等的方法進(jìn)行改進(jìn)。

1.2.4.1 對(duì)照品與供試品溶液的制備 對(duì)照品溶液精密稱取葡萄糖100mg,加適量水溶解,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得1.0mg/mL對(duì)照品溶液。精密吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于試管中,加水稀釋至5.0mL,搖勻,即得濃度為0、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的對(duì)照品溶液。供試品溶液精密稱取萌芽0～6d赤小豆萌芽粉末各1.0g于試管中,加入去離子水10mL,功率100W,45℃超聲提取120min,以12000r/min離心5min,取上清液,待測(cè)。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取不同濃度葡萄糖溶液0.2mL放入試管中(另取0.2mL去離子水做空白對(duì)照)加入0.1mL 5%苯酚溶液,震蕩混合均勻。再加入0.5mL濃硫酸,混勻5min后,封管沸水浴1h。最后,取出冷卻至室溫,使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在490nm處測(cè)吸光值。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),相應(yīng)葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 總多糖含量的測(cè)定 取0.2mL樣品溶液,按上述步驟操作,分別在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總多糖含量。

1.2.5 總皂苷含量測(cè)定 參照閆婕[13]等的方法進(jìn)行改進(jìn)。

1.2.5.1 對(duì)照品與供試品溶液的制備 對(duì)照品溶液精密稱定齊墩果酸對(duì)照品2.0mg,置10mL量瓶中,加75%甲醇超聲溶解定容,制得每0.2mg/mL對(duì)照品溶液,冰箱冷藏待用。供試品溶液精密稱取萌芽0～6d赤小豆萌芽粉末各1.0g于試管中,加入100%甲醇10mL,超聲提取30min,以12000r/min離心5min,取上清液,待測(cè)。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08mL,于具塞試管中,水浴揮干溶劑,各加入新配制的0.5%香草醛-冰醋酸0.2mL,高氯酸0.8mL,密塞搖勻,于70℃水浴中加熱15min,取出立即流水冷卻15min,搖勻。在550nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),相應(yīng)齊墩果酸含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.3 總皂苷含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液0.04mL至具塞試管中,按上述步驟操作,以空白試劑為對(duì)照,在550nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總皂苷含量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果以x±s表示。數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS v17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抗敏活性的最佳天數(shù)確定

赤小豆萌芽過(guò)程中,碳水化合物、蛋白質(zhì)、多酚、有機(jī)酸等物質(zhì)均在發(fā)生變化,其功效可能也在發(fā)生變化。通過(guò)抗敏功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn),主要考查綠豆萌芽的抗敏活性及其隨萌芽過(guò)程的變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)選擇赤小豆萌芽0～6d提取物,進(jìn)行抗敏功效檢測(cè)。

赤小豆0～6d萌芽透明質(zhì)酸酶抑制率如圖1所示。萌芽第4d的抑制率最高,為90.67%±4.82%,并和其它萌芽天數(shù)呈極顯著差異(p<0.01)。赤小豆萌芽過(guò)程中,抗敏活性呈先上升后下降的趨勢(shì),在第4d抗敏活性最佳。推測(cè)在萌芽初期(第0d),赤小豆體內(nèi)的抗敏活性物質(zhì)尚未被完全激活,隨著萌芽過(guò)程的進(jìn)行,抗敏活性物質(zhì)種類和含量發(fā)生了變化,有關(guān)酶的活性也逐漸增強(qiáng),在第4d達(dá)到頂峰,然而隨著萌芽過(guò)程的繼續(xù)進(jìn)行,在萌芽后期,豆芽整體開(kāi)始發(fā)蔫,生命機(jī)能收到衰減,有關(guān)酶的活力逐漸下降,導(dǎo)致赤小豆萌芽抗敏活性降低。

圖1 不同萌芽天數(shù)(0～6d)赤小豆透明質(zhì)酸酶抑制率(%)Fig.1 Hyaluronidase inhibition rate ofrice bean sprout extracts in different days 注:采用Duncan分析,不同字母表示顯著差異性 (p<0.05,n=3)；陽(yáng)性對(duì)照為1%甘草酸二鉀。

2.2 不同萌發(fā)天數(shù)的赤小豆萌芽中總多酚含量測(cè)定

總多酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=1.211x+0.012,R2=0.998(y值為吸光度,x值為加樣濃度),結(jié)果的變化趨勢(shì)如圖2所示。多酚類物質(zhì)是赤小豆萌芽次級(jí)代謝產(chǎn)物中重要的組成部分,以酚酸、黃酮類物質(zhì)為代表,其顯著的抗氧化、抗炎、抗敏功效越來(lái)越受到學(xué)者的關(guān)注。隨著萌芽過(guò)程的進(jìn)行,赤小豆萌芽中總多酚的含量逐漸增高,在第6d達(dá)到最高,為4.65mgGAE/g,與第0d形成極顯著差異(p<0.01),推測(cè)經(jīng)萌芽作用,赤小豆萌芽體內(nèi)包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、黃酮合酶(IFS)在內(nèi)的酶活性得到顯著提升,從而生成更多的總多酚。從圖2中可以看出,萌芽第3d至第4d過(guò)程中,總多酚含量上升了近20%,此結(jié)果與第4d為最佳抗敏活性單天相吻合,推測(cè)赤小豆萌芽抗敏活性的增強(qiáng)與總多酚含量的增加具有緊密聯(lián)系。

圖2 赤小豆萌芽總多酚含量Fig.2 The total polyphenol content of rice bean sprout注:采用Duncan分析,不同字母表示 顯著差異性(p<0.05,n=3)。

2.3 不同萌發(fā)天數(shù)的赤小豆萌芽中總多糖含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=8.395x+0.110,R2=0.999(y值為吸光度,x值為加樣濃度),結(jié)果變化趨勢(shì)如圖3所示。多糖是赤小豆萌芽過(guò)程中重要的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),不僅在能量代謝過(guò)程中起到重要作用,其所特有的藥學(xué)特性和活力在抗敏、抗輻射、抗氧化防衰老、提高免疫力等應(yīng)用中表現(xiàn)出優(yōu)良的生物治療作用。由圖3可知,多糖含量在萌芽前期(0～4d)呈上升的趨勢(shì),并在第4d達(dá)到最高,為84.73mg/g,此結(jié)果與第4d為最佳抗敏活性單天相吻合,推測(cè)赤小豆萌芽抗敏活性與總多糖含量相關(guān)；隨著萌芽過(guò)程的進(jìn)行,在萌芽后期(4～6d)多糖含量逐漸下降,第6d多糖含量為37.44mg/g,僅為第4d的44%。從生命代謝的角度分析,萌芽初期赤小豆萌發(fā)需要多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的維持,因此在此時(shí)期多糖含量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)萌芽進(jìn)入穩(wěn)定期和衰減期后,多糖逐漸分解為次生代謝產(chǎn)物,其含量也逐漸降低。

2.4 不同萌發(fā)天數(shù)的赤小豆萌芽中總皂苷含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=51.98x-0.114,R2=0.999(y值為吸光度,x值為加樣濃度),結(jié)果變化趨勢(shì)如圖4所示。赤小豆萌芽過(guò)程中皂苷類物質(zhì)的含量變化總體變化不大,在第3d含量最高,為5.60±0.42mg/g,僅比萌芽初期(第0d為4.79±0.04)提高了17%。從定量結(jié)果分析,萌芽過(guò)程對(duì)赤小豆中總皂苷的含量影響不大,但不排除皂苷的種類發(fā)生了變化,可以在后期的研究中深入考察。

圖3 赤小豆萌芽總多糖含量Fig.3 Total polysaccharide content of rice bean sprout注:采用Duncan分析,不同字母表示 顯著差異性(p<0.05,n=3)。

圖4 赤小豆萌芽總皂苷含量Fig.4 Total saponin content of rice bean sprout注:采用Duncan分析,不同字母表示 顯著差異性(p<0.05,n=3)。

2.5 各成分含量與抗敏活性的相關(guān)性分析

通過(guò)SPSS 17.0 Spearman相關(guān)性分析,考察萌芽過(guò)程中各活性物質(zhì)總含量的變化與抗敏活性變化之間的相關(guān)性,如圖5所示,多酚類物質(zhì)總含量與赤小豆萌芽抗敏活性的相關(guān)性最高。

圖5 相關(guān)性分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of correlation analysis注:通過(guò)SPSS 17.0 Spearman相關(guān)性分析。

赤小豆萌芽中總多酚含量隨萌芽過(guò)程的進(jìn)行逐漸增多,總多糖的含量呈先降低后升高再降低的趨勢(shì),總皂苷含量隨萌芽過(guò)程變化不明顯,綜上,結(jié)合透明質(zhì)酸酶體外抑制率的變化趨勢(shì),采用SPSS 17.0 Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析,得出結(jié)論,三種活性物總含量的變化與抗敏活性并未呈顯著相關(guān)性,但總多酚的相關(guān)度達(dá)到0.750,與赤小豆萌芽抗敏活性的相關(guān)性最高。

3 結(jié)果與討論

以赤小豆萌芽為考查對(duì)象,利用抗敏活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)、分析化學(xué)方法等手段,總結(jié)了赤小豆萌芽過(guò)程中抗敏活性的變化,研究了赤小豆萌芽活性物質(zhì)隨萌芽過(guò)程的變化規(guī)律。研究結(jié)果表明:以0～6d為萌芽周期,采用體外透明質(zhì)酸酶抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)萌芽提取物抗敏活性,結(jié)果表明4d萌芽提取物抗敏活性較高。萌芽過(guò)程是提高赤小豆多酚類物質(zhì)代謝水平的有效途徑,并發(fā)現(xiàn)萌芽6d時(shí)總多酚含量相比于0d提高了145%。赤小豆萌芽多糖含量呈先升高后降低的趨勢(shì),總皂苷含量隨萌芽進(jìn)程變化不大。今后可深入研究萌芽過(guò)程中活性物質(zhì)單體的種類和含量變化規(guī)律,通過(guò)代謝組學(xué)的方法分析赤小豆萌芽中起抗敏功效的關(guān)鍵物質(zhì)。

本文首次對(duì)赤小豆萌芽的抗敏活性進(jìn)行研究,結(jié)果證明萌芽作用對(duì)于植物藥理活性的積極影響,并且多酚類成分為赤小豆中發(fā)揮抗敏功效的主要活性物質(zhì),本文研究結(jié)果為赤小豆萌芽作為功能食品及功能化妝品植物原料應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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Study on the best sprouting day with anti-allergic activity of red beans and related active substances

LI Li,REN Han-kun,DONG Yin-mao*,SONG Li-ya,ZHANG Xiao-hui,LIU Chang

(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

The anti-allergic activity of 0～6d of rice bean sprouts was determined by the hyaluronic acid enzyme inhibition experimentinvitro. The contents of total saponins,total polyphenols,and total polysaccharides in the sprouting process(0～6d)were also tested. The correlation between the active substances and anti-allergic activity was analyzed in the same time. The results showed that the 4thday of the rice bean sprouts had the highest anti-allergic activity. Different types of components showed different changes in the sprouting process. The results of correlation analysis showed that polyphenols were the active substances with anti-allergic activity.

rice bean;sprouts;anti-allergic;active substances

2014-06-16

李麗(1980-)，女，博士，講師，研究方向：化妝品功效添加劑與配方工藝。

*通訊作者:董銀卯(1963-)，男，博士，教授，研究方向：化妝品科學(xué)與技術(shù)。

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助D類(2012D005003000006)。

TS201.4

A

:1002-0306(2015)09-0335-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.064