姜黃素下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞Notch1信號通路研究

楊 芳，劉少瓊*，李春花，尹 玲，劉 婭，謝婉瑩

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

姜黃素下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞Notch1信號通路研究

楊 芳，劉少瓊*，李春花，尹 玲，劉 婭，謝婉瑩

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

目的檢測Notch1信號通路中Notch intracellular domain蛋白（NICD1蛋白)在大腸腺癌組織中表達(dá)的情況；探討姜黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480及HT29細(xì)胞中Notch1信號通路的影響。方法二步法免疫組化檢測40例結(jié)直腸癌、31例癌旁腸組織石蠟切片中Notch1 intracellular domain蛋白（NICD1)的表達(dá)情況，通過對比人結(jié)腸直腸癌與癌旁正常腸黏膜細(xì)胞中蛋白陽性表達(dá)率判斷NICD1蛋白與人結(jié)直腸癌的關(guān)系；不同濃度姜黃素（0、7.5、15、30、60μmol/L)分別處理結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480和HT29細(xì)胞24 h和48 h后，Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)NICD1、Notch1及HES-1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果NICD1在人結(jié)直腸癌組織中均表達(dá)，陽性率100%，癌旁腸組織中部分表達(dá)，陽性率為90.3%，但癌組織表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；Western blot結(jié)果示姜黃素能下調(diào)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480及HT29細(xì)胞中NICD1、Notch1及HES-1蛋白的表達(dá)，有時(shí)間和劑量依賴。結(jié)論Notch1信號通路中NICD1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的過度表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其陽性表達(dá)的部位可能與癌組織的病理分期有關(guān)；姜黃素可能通過調(diào)控Notch1信號通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。

姜黃素；Notch1通路；NICD；結(jié)直腸癌；結(jié)腸癌細(xì)胞SW480；結(jié)腸癌細(xì)胞HT29

結(jié)直腸癌是常見惡性腫瘤之一，男性和女性患者發(fā)病率分別位居第三位和第二位[1]，亞洲地區(qū)結(jié)直腸癌發(fā)生率和死亡率近幾十年快速增長，亞洲東部國家如中國、日本、韓國和新加坡，發(fā)生率以2倍到4倍速度增長，死亡率增長了35%[2]。結(jié)直腸癌傳統(tǒng)治療方法有外科手術(shù)、放化療等[3]。經(jīng)規(guī)范聯(lián)合化療，可使結(jié)直腸癌病人5年生存率達(dá)42.7%[4]，但放化療給結(jié)直腸癌患者帶來明顯的毒副作用嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此尋找高效、低毒抗腫瘤藥物任重道遠(yuǎn)。

姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的活性成分，相對分子量為368.4，近幾年的研究顯示姜黃素對多種腫瘤有抑制作用，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等[5]，還具備抗炎、抗氧化、防衰老等作用，除了功效多外，其毒副作用小、耐受性好，是極具潛力的抗癌藥物；此外，它還可以提高直腸癌患者對放療的敏感性，增加放射療法的治療效果，而且還可減輕化療藥物帶來的毒副作用，如皮膚損傷、腸道反應(yīng)等[6]。

在哺乳動(dòng)物中，Notch信號主要由配體（Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1、Jagged2)，受體（Notch 1-4）和相關(guān)靶基因：HES和HERP等構(gòu)成。Notch信號激活由臨近細(xì)胞配-受體結(jié)合后，受體蛋白水解，釋放胞漿內(nèi)活性結(jié)構(gòu)域 （Notch intracellular domain，NICD），NICD易位至細(xì)胞核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CSL（人類CBF1/RBPjk、果蠅SU(H)、線蟲Lag-1)結(jié)合，替換出轉(zhuǎn)錄抑制因子，募集轉(zhuǎn)錄激活因子，誘導(dǎo)Notch信號靶基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄[7]。Notch1信號通路在多種腫瘤組織中檢測出表達(dá)，包括乳腺癌、腎癌、食管癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌等，并且Notch1信號與這些腫瘤對化療藥物耐藥及腫瘤向周圍侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。本研究通過免疫組化等方法檢測人結(jié)直腸癌組織中NICD1蛋白的表達(dá)及結(jié)腸腺癌細(xì)胞中 NICD1、Notch1及HES-1蛋白表達(dá)，探討姜黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 病理切片 切片組織篩選來自源于南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2010年至2012年所有大腸癌根治術(shù)患者，標(biāo)本選取腫瘤組織蠟塊及癌旁組織蠟塊，對照組、正常組來源于癌組織切緣，距腫瘤組織>5 cm的切緣組織。其中直腸癌19例，結(jié)腸癌21例，腫瘤組織中高分化11例，中分化25例，低分化4例，男性患者29名，女性患者11名，平均年齡60歲，所有患者均無術(shù)前放化療及其他治療史，所有病例均經(jīng)術(shù)后病理診斷明確。

1.1.2 細(xì)胞系、試劑及儀器 結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480購于湘雅細(xì)胞管理中心，結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT29細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫。無噬菌體胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，MCCOY'S 5A培養(yǎng)基購自sigma公司。姜黃素粉末（HPLC≥98.5%）購于成都瑞芬思生物科技有限公司。兔/鼠DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購于上海諾倫生物公司。兔抗人(Anti-NICD1 antibody，ab83232)購于英國Abcam公司，鼠抗人Anti-human Notch1 Purified（貨號：14-5785）購于affymetrix公司，Anti-HES-1抗體購于GeneTex公司。二抗山羊抗兔購于武漢博士德生物工程有限公司，兔抗鼠購于美國CST公司。蛋白裂解液、蛋白定量液、上樣緩沖液、SDS制膠試劑盒、蛋白Marker、顯影液均購于上海碧云天技術(shù)有限公司，SDS制膠電泳儀及轉(zhuǎn)膜槽產(chǎn)于北京六一公司，PVDF膜購自millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 二步法免疫組化檢測人結(jié)直腸癌組織及癌旁組織蠟塊NICD1蛋白表達(dá)情況 標(biāo)本處理：病理切片常規(guī)脫蠟、水化，蒸餾水洗5 min，PBS漂洗3次，高壓抗原修復(fù)2 min后自然冷卻至37℃以下，PBS漂洗3次，3%H2O2封閉10 min，PBS漂洗 3次，除去PBS液，滴加1滴兔抗人NICD1單克隆抗體（稀釋濃度1∶1200），4℃孵育過夜；次日PBS漂洗3次，滴加聚合物增強(qiáng)劑 （試劑A），37℃孵育20 min，PBS漂洗3次；滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物（試劑B），室溫下孵育30 min，PBS漂洗3次；滴加即用型Maxvision TM試劑，室溫下孵育10 min，PBS漂洗3次。滴加現(xiàn)配DAB顯色劑溶液，顯微鏡下觀察5 min；沖洗后蘇木精復(fù)染、中性樹膠封片。每次PBS漂洗4 min。

1.2.2 組織切片HE染色法 免疫組化相同石蠟標(biāo)本切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色作組織學(xué)診斷。病理切片，常規(guī)脫蠟、水化，蒸餾水洗5 min，蘇木精染色液染色10 min；漂洗后1%鹽酸乙醇3 s；漂洗后0.5%伊紅液染色；梯度酒精漂洗后中性樹膠封固。

由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師讀片，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：NICD1蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核。用陽性細(xì)胞數(shù)量和著色程度兩項(xiàng)加權(quán)法，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50% ～75%為3分，＞75%為4分；著色程度淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩者相加，總分1～2分計(jì)為“-”，3分計(jì)為“+”，4分計(jì)為“++”，≥5分為“+++”。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白免疫印跡 （1）細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，加1%青-鏈霉素雙抗，于5%CO2，37℃孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW 480，同樣條件，用含10%胎牛血清的MCCOY’S 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸腺癌HT29細(xì)胞，1～2 d換液1次；待其貼壁生長融合至80%左右時(shí)，使用0.25%胰酶消化傳代。姜黃素粉末溶于二甲基亞砜（DMSO），母液濃度為1 mol/mL，經(jīng)0.22μm無菌過濾器過濾后4℃冰箱避光保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成工作液，并使工作液中DMSO最終濃度＜0.01%。（2）蛋白免疫印跡取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，均勻接種到6孔板，待其貼壁后加入含姜黃素培養(yǎng)基，濃度分別為0、7.5、15、30、60μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，經(jīng)消化、離心、洗滌收集細(xì)胞后加入含PMSF裂解液冰上裂解30 min；裂解后12 000 r/min離心10 min收集上清液，蛋白定量后加蒸餾水稀釋配平，使每組總蛋白量均等。加入SDS上樣緩沖液混勻后99℃煮沸5 min變性。

按照制膠試劑盒說明步驟配制分離膠和濃縮膠，根據(jù)蛋白分子量選擇10%分離膠，取25μL蛋白上樣，恒壓電泳，濃縮膠電泳80 v，30 min；分離膠電泳120 v，90 min，電泳后轉(zhuǎn)膜，大分子使用0.45μm PVDF膜、小分子使用0.22μm PVDF膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜條件：4℃冰浴中恒流200 mA，90 min。轉(zhuǎn)膜完成后5%脫脂牛奶封閉2 h后37℃一抗孵育1 h、4℃過夜。次日TBST漂洗濾膜3次，每次10 min，加入二抗37℃搖床孵育1 h，TBST漂洗濾膜3次，每次10 min，采用化學(xué)免疫發(fā)光法對膜進(jìn)行顯影，一抗稀釋比例：NICD1（1∶1000），內(nèi)參（1∶500），Notch1（1∶500），HES-1（1∶800）；二抗山羊抗兔：1∶3000，兔抗鼠：1∶2000。內(nèi)參β-actin、NICD1、Notch1、HES-1蛋白分子量分別為 43、88、110、30 kDa。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，免疫組化采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，蛋白免疫印跡圖片使用Image J軟件掃描，所得目的蛋白灰度比值=目的條帶灰度值/內(nèi)參灰度值，采用ONEANOVA雙因素檢驗(yàn)；P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Notch1信號通路中NICD1蛋白在人結(jié)直腸腺癌及癌旁腸組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，NICD1的陽性顆粒主要分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，表達(dá)情況見表1、封三彩圖圖1，P=0.000＜0.05，可認(rèn)為癌組織中NICD1表達(dá)強(qiáng)于癌旁組織，相同組織HE染色見封三彩圖圖2。

2.2 蛋白免疫印跡法檢測蛋白

表1結(jié)直腸腺癌與癌旁組織中NICD1的蛋白表達(dá)

結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT29和結(jié)腸癌SW480細(xì)胞分別用不同濃度姜黃素 （0、7.5、15、30、60μmol/L）處理24 h和48 h后，Notch1通路中受體蛋白Notch1，通路中活性蛋白NICD1，下游靶蛋白HES-1的表達(dá)情況：Notch1、NICD1、HES-1、β-actin蛋白免疫印跡結(jié)果見圖3、圖4，姜黃素降低了結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT29和SW480細(xì)胞中Notch1、NICD1、HES-1蛋白的表達(dá)，有濃度和時(shí)間依賴；姜黃素處理組（60μmol/L）與對照組 （0μmol/L）相比，Notch1、NICD1、HES-1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.0001＜0.01）；姜黃素處理HT29細(xì)胞24 h和48 h，相同濃度處理不同時(shí)間，Notch1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.296 0＞0.01），而NICD1和HES-1蛋白表達(dá)有差異（P＜0.000 1＜0.01），見圖5；姜黃素處理SW480細(xì)胞HT29細(xì)胞24 h和48 h，相同濃度處理不同時(shí)間，Notch1、NICD1、HES-1 3種蛋白表達(dá)均有意義（P＜0.000 1＜0.01），見圖6；相同濃度姜黃素處理結(jié)腸腺癌HT29與SW480相同時(shí)間，蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 結(jié)腸腺癌HT29細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理24 h（A）和48 h（B）蛋白表達(dá)

圖4 結(jié)腸腺癌SW480細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理24 h（C）和48 h（D）蛋白表達(dá)

3 討論

結(jié)直腸癌是常見惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是由遺傳和生理改變多種因素作用共同而成，其主要分子機(jī)制尚未明確。Notch信號通路與腫瘤的相關(guān)性最先在1991年T細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病中確定，認(rèn)為Notch信號通路失調(diào)控誘發(fā)腫瘤，屬于致癌信號通路[9]。然而，隨著研究的深入，人們對Notch信號的認(rèn)識逐漸加深，Notch信號通路在腫瘤組織中異常活性具有兩面性，致癌作用或抑癌作用，這主要取決于組織或細(xì)胞類別的不同[10]，包括曾經(jīng)認(rèn)為Notch信號通路是致癌作用的T細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性B淋巴細(xì)胞性白血病等，被證實(shí)其起抑癌作用[11]。Notch信號通路激活由臨近細(xì)胞配-受體結(jié)合后，Notch受體蛋白裂解，釋放胞內(nèi)活性結(jié)構(gòu)域 （Notch-ICD，NICD)，NICD由胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與核內(nèi)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子RBP-J、MAML結(jié)合成RBP-J/NICD/MAML激活復(fù)合體，作為啟動(dòng)子誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄，當(dāng)NICD在核內(nèi)大量磷酸化和泛素化后，其轉(zhuǎn)錄激活的功能停止，這意味著Notch信號終止[12]。Notch1信號通路是Notch信號通路之一，它能在結(jié)直腸腫瘤組織中高表達(dá)并在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中起致癌作用，不僅如此，Notch1在組織中高表達(dá)與病人總生存期短以及病人預(yù)后差有關(guān)，因此Notch1基因表達(dá)可作為判斷預(yù)后和治療結(jié)直腸癌的潛力生物標(biāo)記[13]。Hristova NR等[14]認(rèn)為p27及skp2在Notch1信號通路中起重要作用，并且Notch1是結(jié)直腸腺癌治療靶點(diǎn)。

姜黃素是中藥姜黃中提取的活性成分，已有研究者對姜黃素進(jìn)行了Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，結(jié)果示姜黃素結(jié)合其他化療藥物使用，能減輕化療藥物的毒副作用，減少化療藥物的使用劑量，提高患者的生存質(zhì)量、延長生存時(shí)間；且姜黃素?zé)o明顯副作用，患者耐受性好，可作為結(jié)直腸癌長期預(yù)防治療方案[15]。

以往的研究表明Notch1蛋白能在結(jié)直腸癌組織中過度表達(dá)[16]，而NICD1的表達(dá)尚未報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果示NICD1能在結(jié)直腸腺癌組織中表達(dá)，并且表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁組織，進(jìn)一步證實(shí)了Notch1信號通路在結(jié)直腸腺癌中起致癌效應(yīng)。

已有研究表明姜黃素能抑制結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT29和SW480細(xì)胞大的增殖并促進(jìn)其凋亡[17-18]，本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用不同濃度姜黃素處理以上2種細(xì)胞，使用免疫蛋白印跡方法檢測 Notch1信號通路中NICD1、Notch1及下游靶基因HES-1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果示三種蛋白表達(dá)均降低，有時(shí)間和劑量依賴，同樣本研究前期工作檢測到姜黃素能降低與Notch1信號相關(guān)的skp2蛋白表達(dá)，增加p27蛋白表達(dá)[19]，因此，姜黃素通過下調(diào)Notch1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)可能是其抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡的分子機(jī)制；從數(shù)據(jù)來看，姜黃素對結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW 480細(xì)胞和HT29細(xì)胞中各蛋白的抑制程度有差異，考慮與細(xì)胞表達(dá)的Notch1信號強(qiáng)弱不等以及細(xì)胞對姜黃素的敏感性差異相關(guān)，這也是本課題進(jìn)一步研究的方向。

圖5 結(jié)腸癌細(xì)胞HT29經(jīng)姜黃素處理后HES1、NICD1、HES1蛋白表達(dá)相對值比較

圖6 結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理后Notch1、NICD1、HES1蛋白表達(dá)相對值比較

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（本文編輯 楊 瑛）

Study of Curcum in on Down-regulating Notch1 Pathway in Colorectal Cancer Cells

YANG Fang,LIU Shaoqiong*,LI Chunhua,YIN Ling,LIU Ya,XIE Wanying
(The First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo test the expression of Notch1 intracellular domain(NICD1)in human colorectal cancer tissue and to investigate the mechanism of curcumin on the effect of the Notch1 pathway in the human colon cancer cells SW480 and HT29.MethodsThe expression of NICD1 in paraffin section from 40 cases of human colorectal cancer and 31 cases of adjacent tissues were detected by the immunohistochemical method.The relation of NICD1 with human colorectal cancer was determined by comparing the protein expression rate in intestinal mucosal cells of human colorectal cancer and tissues.The protein expressions of NICD,Notch1 and HES-1 in the colon cancer cells SW480 and HT29 which were treated by different concentrations of curcumin(0,7.5,15,30,60μmol/L)at 24 h and 48 h,were tested by western blot assay.ResultsThe expression rate of NICD1 in human colorectal cancer tissues was 100%,and the rate in adjacent tissues was 90.3%,the expression rate in colorectal cancer tissues was more significant than that in the adjacent tissues (P<0.05).The Weston blot result showed that curcumin could down-regulate the expressions of NICD1,Notch1 and HES-1 in SW480及HT29 cells with a time-dose independence.ConclusionOver-expression of NICD1 protein in colorectal tissues may be related with the development and progression of cancer.The position of positive expression could be associated with pathological stage of cancer tissues.Curcumin inhibiting proliferation of the colorectal cancer cells may relied on down-regulating Notch1 pathway.

curcumin;Notch1 pathway;NICD;colorectal cancer;SW480;HT29

R285.6；R735.3+7

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.003

2014－10－12

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（11JJ6083）。

楊 芳，女，在讀碩士研究生。

*劉少瓊，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：liushaoqiong861224@163.com。