一種測定大白菜霜霉病菌對甲霜靈敏感性方法的建立及應用

楊麗娟， 趙洪海， 梁 晨， 郭延蕊， 史素娟， 劉 偉

（青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與植物保護學院，山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109）

一種測定大白菜霜霉病菌對甲霜靈敏感性方法的建立及應用

楊麗娟， 趙洪海， 梁 晨*， 郭延蕊， 史素娟， 劉 偉

（青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與植物保護學院，山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109）

建立了一種新方法—離體子葉浸泡法并用于大白菜霜霉病菌對甲霜靈敏感性的檢測。離體子葉在含有0.005%吐溫20和0.1%丙酮的甲霜靈中浸泡3 h后，接種濃度為1×104孢子囊/mL的大白菜霜霉病菌孢子囊懸浮液，保濕培養(yǎng)6 d后觀察子葉發(fā)病狀況。采用離體子葉浸泡法測定了50株大白菜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性，結果顯示部分大白菜霜霉病菌菌株對甲霜靈的敏感性降低，有抗藥性亞群體出現(xiàn)。研究表明離體子葉浸泡法重復性好，具有較高的敏感性和精密度，符合生產(chǎn)實際，適用于大白菜霜霉病菌對殺菌劑的敏感性檢測。

大白菜霜霉病菌； 離體子葉浸泡法； 甲霜靈； 敏感性

霜霉病是大白菜上的重要病害，在病害流行年份給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失可達50%以上，甚至在局部地區(qū)造成絕產(chǎn)絕收［1-2］。目前，化學防治仍是控制大白菜霜霉病的主要措施。但是，隨著殺菌劑特別是內(nèi)吸性殺菌劑的大量施用，防治效果明顯下降［3-4］。因此，明確大白菜霜霉病菌的抗藥性是現(xiàn)有殺菌劑能否長期使用的關鍵［3］，而病原菌的敏感性檢測是進行殺菌劑抗藥性監(jiān)測的基礎。目前，國內(nèi)外并沒有大白菜霜霉病菌敏感性檢測方法的報道。大白菜霜霉病菌［Peronospora parasitica（Pers.）Fr.］屬于專性寄生菌，難以采用菌絲生長速率法進行敏感性檢測，而孢子囊萌發(fā)法只適用于抑制孢子囊萌發(fā)的殺菌劑，對其他作用機制的殺菌劑具有一定的局限性［5-6］。因此本文就大白菜霜霉病菌甲霜靈敏感性測定的條件及技術進行研究，旨在建立以大白菜子葉為材料的離體抗藥性標準化測定方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從山東、河南、江蘇、湖北及廣東等省的12個地點采集新鮮大白菜霜霉病病葉，經(jīng)活體接種分離獲得50株寄生霜霉，采用離體子葉冷凍法保藏于青島農(nóng)業(yè)大學真菌學研究室。以大白菜霜霉病感病品種‘魯白七號’的離體子葉作為接種材料。大白菜子葉的培養(yǎng)和采集、孢子囊懸浮液的配制及菌株的保藏方法參考楊麗娟等的方法［7］。

1.2 供試藥劑

98%甲霜靈（metalaxyl）原藥由中國農(nóng)業(yè)大學劉西莉教授惠贈。上述藥劑預溶于丙酮中并配制成1.0×104μg/mL的母液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 離體子葉浸泡法

大白菜新鮮子葉清洗后，用滅菌的吸水紙將子葉上多余的水分吸干，待下述不同處理后，子葉背面朝上整齊地擺放于用吸水紙保濕的直徑150 mm培養(yǎng)皿中，每皿10片子葉，每片子葉背面接種10μL大白菜霜霉病菌孢子囊懸浮液，然后置于15℃、12 h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，6 d后調(diào)查子葉發(fā)病情況，計算病情指數(shù)；每處理3次重復，試驗重復2次。大白菜離體子葉霜霉病病情分級標準參見楊麗娟等［7］。

1.3.1 大白菜霜霉病菌接種濃度

試驗設置1×103、1×104和1×105孢子囊/mL等3個接種濃度處理，分別接種于不同培養(yǎng)皿中的子葉背面。

1.3.2 展著劑和溶劑

參考朱書生［8］的展著劑及溶劑濃度，配制0.005%吐溫20溶液、0.005%吐溫20+0.1%丙酮溶液和0.1%丙酮溶液各20 mL。將子葉背面朝下在上述3種溶液中浸泡3 h后取出，于子葉背面接種濃度為1×104孢子囊/mL的孢子囊懸浮液，對照為無菌水處理。

1.3.3 離體子葉在藥液中浸泡時間

將子葉背面朝下在含有0.005%吐溫20+ 0.1%丙酮的甲霜靈藥液（1.15μg/mL，為甲霜靈抑制大白菜霜霉病菌50%孢子囊萌發(fā)的濃度）中分別浸泡1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h后取出，于子葉背面接種濃度為1×104孢子囊/mL的孢子囊懸浮液。

1.3.4 離體子葉浸泡法精密度試驗

選用3個大白菜霜霉病菌菌株，取準備好的大白菜子葉，將子葉背面朝下浸泡于含有0.005%吐溫20+0.1%丙酮的甲霜靈系列濃度梯度藥液中3 h后，在子葉背面接種濃度為1×104孢子囊/mL的孢子囊懸浮液。比較各菌株3次重復間EC50的變異系數(shù)。

1.4 大白菜霜霉病菌對甲霜靈敏感性檢測

按照1.3.4中離體子葉浸泡法的步驟測定50株大白菜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

子葉的發(fā)病率和病情指數(shù)全部通過反正弦轉換，采用SAS 8.1軟件中的Duncan氏新復極差法，比較不同處理中子葉發(fā)病率和病情指數(shù)（P＝0.05），并進行方差分析。根據(jù)子葉病情指數(shù)計算各濃度梯度藥液對大白菜霜霉病菌的抑制率，查百分率幾率值表，以抑制率幾率值為縱坐標，藥液濃度對數(shù)為橫坐標，采用Excel 2007軟件建立藥劑對大白菜霜霉病菌的毒力回歸曲線，計算藥劑對大白菜霜霉病菌的EC50。

2 結果與分析

2.1 離體子葉浸泡法的確定

2.1.1 大白菜霜霉病菌孢子囊懸浮液接種濃度

比較了3個不同接種濃度的孢子囊懸浮液對子葉發(fā)病的影響，試驗結果表明，3個處理的發(fā)病率之間差異不顯著，但處理之間的病情指數(shù)差異顯著。3個處理的子葉發(fā)病率較高，為93.33%～100%；接種濃度為1×103孢子囊/m L的子葉發(fā)病較輕，病情指數(shù)為38.52，發(fā)病面積較??；接種濃度為1×104孢子囊/mL的子葉病情指數(shù)最高，為78.52，霉層均勻地布滿整片子葉；接種濃度為1×105孢子囊/mL的子葉只有接種點部位發(fā)病，病斑并未擴展至整片子葉，部分葉片接種點腐爛。接種濃度為1×103孢子囊/mL與1×105孢子囊/mL的子葉發(fā)病面積均小于1×104孢子囊/mL。因此，選擇1×104孢子囊/mL作為離體子葉浸泡法的接種濃度（表1）。

表1 大白菜霜霉病菌孢子囊懸浮液濃度對子葉發(fā)病的影響1）Table 1 The effect of sporangium suspension concentration ofPeronospora parasiticaon the disease severity of cotyledon

2.1.2 表面展著劑和有機溶劑

由表2可知，大白菜子葉在吐溫20和丙酮及其組合等3種溶液處理后，子葉的發(fā)病率均為100%，其中含有0.005%的吐溫20的處理與對照的病情指數(shù)相等，0.005%的吐溫20+0.1%的丙酮處理的病情指數(shù)比對照偏高，但發(fā)病率和病情指數(shù)與對照均無顯著性差異。表明在進行子葉浸泡處理時，濃度為0.005%的吐溫20可以作為表面展著劑，丙酮可以作為溶解原藥的有機溶劑。

表2 表面展著劑和有機溶劑對子葉發(fā)病的影響1）Table 2 The effect of surface spreader and organicsolvent on the disease severity of cotyledon

2.1.3 離體子葉浸泡時間

如表3所示，在甲霜靈藥液中分別浸泡1～4 h的大白菜離體子葉接種后，浸泡時間在1～2 h、2.5 h、3～4 h三者之間的子葉的病情指數(shù)和抑制率差異均顯著。浸泡1 h的子葉病情指數(shù)最高，為67.41，浸泡4 h的子葉病情指數(shù)最低為27.41。浸泡1～2 h的子葉發(fā)病較重，抑制率小于50%；浸泡3 h時，藥液對子葉病情指數(shù)的抑制率為55.43%，最接近50%；浸泡3.5～4 h的子葉病情指數(shù)差異不顯著，但藥液對子葉病情指數(shù)的抑制率顯著大于50%。故選用浸泡3 h作為最佳浸泡時間。

表3 浸泡時間對子葉發(fā)病的影響1）Table 3 The effect of soaking time on the disease severity of cotyledon

2.1.4 離體子葉浸泡法精密度

采用離體子葉浸泡法測定了3株大白菜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性，結果表明，每個菌株毒力回歸方程的相關系數(shù)均大于0.900 0，3個菌株3次重復間EC50的變異系數(shù)在1.11%～7.53%之間。表明子葉浸泡法具有較好的重復性和較高的精密度（表4）。

表4 子葉浸泡法的精密度Table 4 The accuracy degree of cotyledonin vitroimmersion method

2.2 大白菜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性檢測

采用離體子葉浸泡法測定了50株大白菜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性，結果表明，50個菌株對甲霜靈的EC50值范圍為0.024 3～14.302 1μg/mL，平均EC50為（2.218 9±2.884 3）μg/mL，最敏感菌株是HN1，其EC50為0.024 3μg/mL，最不敏感菌株是CY4，其EC50為14.302 1μg/mL，是最敏感菌株的588.56倍。由表5可知，有16個菌株對HN1的EC50倍數(shù)超過了100倍，占所測菌株的32%。同時，由圖1可以看出，大白菜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性頻率分布并不呈單峰曲線，在0～0.5μg/mL、1.5～2.5μg/mL及＞6.0μg/mL的EC50范圍內(nèi)均出現(xiàn)了峰值。表明大白菜霜霉病菌的供試菌株對甲霜靈出現(xiàn)了敏感性分化，已經(jīng)有抗藥性亞群體產(chǎn)生（表5）。

表5 50株大白菜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性Table 5 Sensitivity of 50P.parasiticastrains to metalaxyl

圖1 50株大白菜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性頻率分布Fig.1 Frequency distribution of sensitivity of 50P.parasiticastrains to metalaxyl

3 結論與討論

本文通過對大白菜霜霉病菌孢子囊懸浮液接種濃度、子葉在藥液中浸泡時間以及藥液中表面展著劑和有機溶劑的初步研究，建立了一種大白菜霜霉病菌對甲霜靈敏感性檢測的新方法—離體子葉浸泡法。采用0.005%吐溫20作為表面展著劑，低于0.1%的丙酮作為有機溶劑配制原藥的母液，以大白菜霜霉病感病品種‘魯白七號’的離體子葉作為接種材料，將子葉背面朝下在藥液中浸泡3 h后，于葉背接種10μL濃度為1× 104孢子囊/mL的懸浮液。15℃，12 h光暗交替保濕培養(yǎng)6 d后調(diào)查病情。本方法與葉盤法比較具有試驗周期短，精密度高、重復性好、穩(wěn)定性較高，且操作相對簡便等特點。采用本方法可以準確、可靠地測定甲霜靈對大白菜霜霉病菌的毒力和檢測田間大白菜霜霉病菌對甲霜靈敏感性，為殺菌劑作用機制和抗藥性研究及治理提供了技術支撐，具有重大的社會經(jīng)濟意義。

［1］ 裘維蕃，章一華.解決白菜三大病害的研究途徑［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，1961（5）：16 22.

［2］ 李彬，袁希漢.國家科技攻關白菜抗病育種進展［J］.長江蔬菜，2000（1）：3 6.

［3］ 司乃國，劉君麗.卵菌病害的化學防治現(xiàn)狀與防治策略［J］.農(nóng)藥，2000，39（2）：7 10.

［4］ 張純胄，胡學博，陳永兵，等.幾種殺菌劑對白菜霜霉病菌孢子囊萌發(fā)的抑制及田間藥效［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2000，12（2）：104 105.

［5］ 慕立義.植物化學保護研究法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994：72 84.

［6］ Locher F J，Lorenz G.Methods for monitoring the sensitivity ofBotrytis cinereato dicarboximide fungicides［EB］.FRAC Methods for Monitoring Fungicide Resistance，1996，26：341 354.

［7］ 楊麗娟，梁晨，李寶篤.大白菜霜霉病菌孢子囊的保藏方法［J］.菌物學報，2013，32（6）：1071 1078.

［8］ 朱書生.黃瓜霜霉病菌對氟嗎啉的抗藥性風險評估及氟馬啉作用機制初探［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2004.

Establishment and application a method for testing the sensitivity ofPeronospora parasiticato metalaxyl

Yang Lijuan， Zhao Honghai， Liang Chen， Guo Yanrui， Shi Sujuan， Liu Wei
（Key Lab of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province，College of Agronomy
and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao266109，China）

A new method，cotyledonin vitroimmersion method，was established and used for detecting the sensitivity of Chinese cabbage downy mildew pathogen（Peronospora parasitica）to metalaxyl.After soaked for 3 h in metalaxyl with 0.005%Tween 20 plus 0.1%acetone，the cotyledonsin vitrowere artificially inoculated with sporangium suspension（1×104sporangium/mL），then incubated in the moist chamber，and the disease severity was checked after 6 d of culture.Sensitivity of 50P.parasiticastrains to metalaxyl was tested.The results revealed that sensitivity of some strains decreased significantly and resistant subpopulations emerged.The studies indicated that the method was suitable for the sensitivity detection ofP.parasiticato fungicides and in accord with practice for its good repeatability and higher sensitivity and precision.

Peronospora parasitica； cotyledonin vitroimmersion method； metalaxyl； sensitivity

S 436.341.12

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.023

2014 02 10

2014 05 29

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003004）；“泰山學者”建設工程專項經(jīng)費

*通信作者 E-mail：syliangchen@163.com