脂多糖對B R L大鼠肝細胞的損傷研究

黃敏聰，潘偉，盧覓佳，張馬娟，夏麗娟，宣堯仙

（浙江省醫(yī)學科學院，浙江 杭州310013）

脂多糖對B R L大鼠肝細胞的損傷研究

黃敏聰，潘偉，盧覓佳，張馬娟，夏麗娟，宣堯仙

（浙江省醫(yī)學科學院，浙江 杭州310013）

目的研究脂多糖（LPS）對BRL大鼠肝細胞的損傷作用。方法體外培養(yǎng)BRL大鼠肝細胞，經(jīng)不同濃度LPS處理細胞后，檢測BRL大鼠肝細胞的增殖能力和凋亡率，以及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性，腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素10（IL-10）細胞因子含量。結(jié)果脂多糖在一定程度上能抑制BRL大鼠肝細胞增殖，并且呈濃度依賴性，高濃度脂多糖（200mg/L）能夠升高細胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT活性，提高TNF-α含量及降低IL-10含量。結(jié)論高濃度脂多糖（200mg/L）能造成BRL大鼠肝細胞的損傷，損傷作用可能與打破促壞死因子與保肝因子之間的平衡有關。

脂多糖；BRL大鼠肝細胞；增殖；凋亡；細胞因子

脂多糖（LPS）是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分，又稱內(nèi)毒素，常被用來制備免疫型肝損傷模型[1]，郭竹英等[2]報道LPS能夠升高大鼠原代肝細胞細胞上清TNF-α等含量并抑制細胞生長。而周鈞等[3]報道LPS在80mg/L濃度下對人正常肝細胞L02體外培養(yǎng)并無明顯的TNF-α含量變化和毒性作用，故不宜選用人肝細胞L02細胞株來研究LPS對肝臟的損傷作用。原代大鼠肝細胞一般采用灌注法分離獲得，分離成本和技術要求較高，細胞活性與穩(wěn)定性差異較大，難以保證實驗的重復性和可操作性。BRL大鼠肝細胞相對于大鼠原代肝細胞更容易獲取和培養(yǎng)，并且活性和穩(wěn)定性更佳，能保證實驗數(shù)據(jù)的準確性。因此本研究選擇BRL大鼠肝細胞作為實驗對象，并設置不同濃度梯度的LPS，觀察其對BRL大鼠肝細胞生長增殖的影響和對肝細胞損傷的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基（吉諾生物技術有限公司，批號14032004）；胎牛血清（BBI生命科學有限公司，批號WD0213B10014J）；凋亡試劑盒 （生工生物工程股份有限公司，批號DY0404B14L）；AST、ALT檢測試劑（杭州德格醫(yī)療設備有限公司，批號00001133）；CCK-8試劑盒（DOJINDO，批號FJ799）；DMSO（BIOSHARP，批號D-5879）；大鼠TNF-α、IL-10檢測試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號：20140801A）。二氧化碳培養(yǎng)箱 （美國熱電）、全自動生化分析儀（HITACHI 7020）、IX51倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS）、SIGMA2-6離心機（德國SIGMA）、FACS Calibur流式細胞儀 （美國BD）、BioTek Synergy HT酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。脂多糖（Sigma，批號043M4089V），用DMEM培養(yǎng)基將其溶解制成2g/L母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.2細胞株 BRL大鼠肝細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%二氧化碳，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1BRL大鼠肝細胞增殖試驗 BRL大鼠肝細胞臺盼藍染色計數(shù)，以每孔5×104個細胞種于96孔板內(nèi)，加入梯度濃度的脂多糖（2、10、20、50、100mg/L）處理細胞20小時后，加入CCK-8試劑，再培養(yǎng)4小時，酶標儀450nm測定吸光度（OD）值，計算細胞的存活率。存活率（%）=藥物組平均吸光度/對照組平均吸光度×100%。

1.2.2BRL大鼠肝細胞損傷試驗 BRL大鼠肝細胞臺盼藍染色計數(shù)，以每孔5×105個細胞種于12孔板內(nèi)，設置正常對照組（溶劑培養(yǎng)液對照）和脂多糖高劑量組（200mg/L）和低劑量組（10mg/L）處理細胞24小時。完全吸取細胞培養(yǎng)液，1500r/min離心5分鐘，吸取上清液用于ALT、AST、TNF-α、IL-10等指標的檢測。用0.25%無EDTA胰酶消化BRL大鼠肝細胞，收集細胞置離心管，PBS洗滌后加入結(jié)合緩沖液，先加入Annexin V-FITC避光孵育15分鐘后離心棄上清液，結(jié)合緩沖液重懸細胞再加入PI染色液，1小時內(nèi)完成上機檢測。

1.3統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)用 （）表示，用SPSS 22.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1脂多糖對大鼠肝細胞增殖的影響 脂多糖2、10、20、50、100 mg/L組的BRL大鼠肝細胞增殖率分別為正常對照組的98%、97%、95%、90%、89%，提示脂多糖對BRL大鼠肝細胞生長增殖具有一定的抑制作用，且呈濃度依賴性。詳見圖1。

圖1 不同濃度LPS對BRL大鼠肝細胞增殖的影響

2.2脂多糖對ALT、AST、IL-10和TNF-α含量的影響 對照組與脂多糖低濃度組比較，ALT、AST、IL-10和TNF-α四個指標差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），而脂多糖高濃度組較低濃度組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。提示脂多糖10mg/L濃度對BRL大鼠肝細胞的損傷作用不明顯，而20 0mg/L濃度時損傷較顯著，并且對細胞的損傷作用可能與細胞因子水平具有一定的關系。詳見表1。

表1 三組ALT、AST、IL-10和TNF-α含量的比較（）

表1 三組ALT、AST、IL-10和TNF-α含量的比較（）

與脂多糖低濃度組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 濃度（m g / L） A L T（U / L） A S T（U / L） I L -1 0（n g / L） T N F -α（n g / L）對照組 6 - 0 . 7 1 ± 0 . 2 9 3 . 9 9 ± 1 . 1 1 5 6 . 5 5 ± 4 . 3 3 2 5 1 . 7 6 ± 1 1 . 2 5脂多糖低濃度組 6 1 0 1 . 1 3 ± 0 . 3 7 5 . 4 2 ± 1 . 5 6 5 4 . 4 9 ± 6 . 2 7 2 4 3 . 0 3 ± 3 1 . 1 8脂多糖高濃度組 6 2 0 0 1 . 7 8 ± 0 . 6 2*7 . 9 2 ± 2 . 1 5*4 3 . 3 1 ± 1 . 9 9**2 9 3 . 6 3 ± 1 5 . 0 8*

2.3脂多糖對大鼠肝細胞凋亡的影響 對照組與脂多糖低濃度組的細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；脂多糖高濃度組較低濃度組細胞的凋亡率明顯升高（P＜0.01），提示脂多糖200mg/L濃度能夠誘導BRL細胞凋亡或壞死。詳見表2。

表2 三組BRL大鼠肝細胞凋亡率比較（，%）

表2 三組BRL大鼠肝細胞凋亡率比較（，%）

與脂多糖低濃度組比較**P＜0.01

組別 n 濃度（mg/L） 凋亡率對照組 4 - 11.98±4.31脂多糖低濃度組 4 10 12.39±3.08脂多糖高濃度組 4 200 45.13±9.98**

3 討論

本文采用BRL大鼠肝細胞作為試驗對象，觀察脂多糖對BRL大鼠肝細胞的損傷作用。增殖實驗結(jié)果顯示，脂多糖能夠一定程度上抑制BRL大鼠肝細胞增殖作用，且呈濃度依賴性，脂多糖2、10、20、50、100 mg/L濃度對BRL大鼠肝細胞增殖的抑制率分別為2%、3%、5%、10%、11%。損傷實驗顯示脂多糖10mg/L組細胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT有上升趨勢，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明脂多糖低濃度組對細胞凋亡壞死影響不明顯，而脂多糖200mg/L能明顯升高細胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT活性，并明顯升高細胞凋亡率，提示高濃度脂多糖能明顯損傷BRL大鼠肝細胞，證實脂多糖有一定肝毒性。

TNF-α作為肝炎早期的改變指標而被廣泛地研究，也是內(nèi)毒素血癥中造成肝細胞凋亡的終末介質(zhì)，脂多糖能夠刺激機體或細胞產(chǎn)生TNF-α。在脂多糖和藥物共同給予的實驗中，采用各種TNF-α抑制劑來減少或阻斷TNF-α的產(chǎn)量或降低TNF-α的活性均能起到減少肝損傷的作用[4]。IL-10主要由活化的枯否氏細胞、T細胞、肝索內(nèi)皮細胞及肝細胞分泌[5]。IL-10一方面可以通過降低促壞死因子（TNF-α、IL-1β、IL-8、IFN-γ等）的表達分泌[6-8]，另一方面可以促進肝細胞的再生[9-10]。IL-10的抗炎癥作用在許多肝損傷模型中 （如伴刀豆蛋白、四氯化碳、酒精致肝損傷等）多有所體現(xiàn)[11]。本組脂多糖高濃度組 TNF-α水平遠高于低濃度組（P＜0.01），而IL-10水平遠低于脂多糖低濃度組（P＜0.01），也提示肝損傷的發(fā)生與促壞死因子與保肝因子之間的平衡有一定的關系。肝臟促壞死因子如TNF-α可以通過增強炎癥反應、干擾肝臟再生或直接損傷肝細胞而增加肝損傷的敏感性，肝保護因子如IL-10可以通過抑制炎癥因子而起到一定的保護作用。本實驗中，脂多糖高濃度組在明顯地降低細胞上清中的IL-10含量的同時明顯地升高了TNF-α的含量，從而導致了BRL大鼠肝細胞的損傷，提示脂多糖致肝損傷作用可能與打破促壞死因子與保肝因子之間的平衡有關，具體機制有待進一步深入研究。

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浙江省醫(yī)學科學院青年基金（2013Y007）；浙江省科學技術廳項目（2013F20005）