頭頸部鱗癌中α-catulin表達(dá)的臨床病理和預(yù)后意義

邱波，張卓，申道福，楊雪峰，鄭華川，高野康雄，黃克強(qiáng)

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，遼寧 錦州 121001；3.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤中心，遼寧 錦州 121001；4.日本神奈川癌中心，橫濱 241-0815，日本）

頭頸部鱗癌中α-catulin表達(dá)的臨床病理和預(yù)后意義

邱波1，張卓2，申道福3，楊雪峰3，鄭華川3，高野康雄4，黃克強(qiáng)1

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，遼寧 錦州 121001；3.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤中心，遼寧 錦州 121001；4.日本神奈川癌中心，橫濱 241-0815，日本）

目的細(xì)胞骨架連接蛋白α-catulin是Rho信號(hào)通路組件之一，在癌細(xì)胞凋亡、抗衰老、細(xì)胞骨架重組、遷移、侵襲和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中發(fā)揮重要作用。探討頭頸部鱗癌中α-catulin表達(dá)的臨床病理和預(yù)后意義。方法采用免疫組化方法檢測(cè)α-catulin在頭頸部鱗狀上皮癌（HNSCC）組織芯片中的表達(dá)，分析其和臨床病理學(xué)特征及生存率的關(guān)系。結(jié)果αcatulin在HNSCC原發(fā)癌中的表達(dá)比正常和異型增生的鱗狀上皮細(xì)胞顯著增高（P＜0.05），但是和HNSCC的惡性生物學(xué)行為和不良預(yù)后無明顯相關(guān)（P＞0.05）。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期是HNSCC的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05）。結(jié)論上調(diào)α-catulin的表達(dá)在HNSCC病因?qū)W上具有重要意義，可作為研究HNSCC腫瘤發(fā)生的分子靶標(biāo)。

頭頸部鱗癌；α-catulin；腫瘤發(fā)生；病理生物學(xué)行為；預(yù)后

頭頸部鱗狀上皮癌（squamous cell carcinoma of the head and neck，HNSCC）是常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別占5%和4%， HNSCC常首要轉(zhuǎn)移至頸部淋巴結(jié)并導(dǎo)致死亡。由于腫瘤干細(xì)胞和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）現(xiàn)象的存在，使HNSCC轉(zhuǎn)移和化療藥物抵抗能力增強(qiáng)［1］。α-連環(huán)蛋白相關(guān)蛋白（α-catulin）是CTNNAL1編碼的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其過表達(dá)可降低E-cadherin并增高N-cadherin、Snail/Slug和MMPs的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［2］。Liang等［3］發(fā)現(xiàn)α-catulin可通過與ILK相互作用而促進(jìn)其下游Akt-NF-κB信號(hào)通路激活，使纖連蛋白和整合素αvβ3表達(dá)增高而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，靶向抑制α-catulin可通過下調(diào)NF-κB和MAPK信號(hào)通路而提高黑色素瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性［4］。這些結(jié)果提示，α-catulin可能通過參與EMT過程提高癌細(xì)胞干細(xì)胞屬性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤演進(jìn)。本研究中主要研究HNSCC發(fā)生過程中α-catulin蛋白表達(dá)及其臨床病理和預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性研究了1995年1月至2008年12月神奈川癌中心附屬醫(yī)院接受手術(shù)和活檢的485例頭頸部鱗癌患者，所有患者均接受神奈川癌中心基于TNM分期的系統(tǒng)治療，接受過治療的HNSCC患者被排除。此外，頭頸部157例正常鱗狀上皮和152例異型增生病例用于HNSCC比較，48例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶也收集到本研究中。HNSCC患者平均年齡51.2歲（20～81歲），通過病志閱讀和電話咨詢進(jìn)行隨訪，根據(jù)赫爾辛基宣言告知患者或其家屬將切除組織進(jìn)行病理學(xué)研究，所有操作規(guī)程通過神奈川癌中心和遼寧醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)。

1.2 病理及組織芯片（TMA）構(gòu)建

所有組織均經(jīng)10%中性甲醛固定并包埋在石蠟中，制備成4 μm病理切片后蘇木精-伊紅（HE）染色確定組織學(xué)診斷和特征。HNSCC的TNM分期依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)，組織學(xué)結(jié)果依據(jù)WHO分級(jí)系統(tǒng)，腫瘤位置、腫塊大小、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等均被確認(rèn)。

在HE染色切片的指引下，病理醫(yī)師選擇代表性區(qū)域，利用直徑2 mm穿刺針切取石蠟標(biāo)本并放入48陣列受體蠟塊的點(diǎn)穴中，所有操作均運(yùn)用芯片機(jī)（AZUMAYA KIN-1，日本）進(jìn)行。

1.3 免疫組化

組織芯片4 μm切片后脫蠟至水，經(jīng)TRS抗原修復(fù)液微波修復(fù)15 min，過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，鼠抗α-catulin抗體（Abcam，1∶40）孵育15 min，HRP標(biāo)記抗鼠IgG（DAKO，1∶1 000）二抗孵育15 min，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，脫水透明封片，操作規(guī)程參照文獻(xiàn)［5］中微波間歇性照射免疫組化的步驟進(jìn)行，不加一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果評(píng)價(jià)

α-catulin蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)或膜上（圖1），由2位病理醫(yī)生隨機(jī)選取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，2者評(píng)價(jià)結(jié)果達(dá)到一致為止。α-catulin陽(yáng)性率分級(jí)：0，0%；1，1%～50%；2，50%～74%；3，≥75%；陽(yáng)性強(qiáng)度分級(jí)：1，弱；2，中等；3，強(qiáng)；評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)=強(qiáng)度×陽(yáng)性率：-，0；+，1～2；++，3～5；+++，6～9。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用Spearman相關(guān)分析處理等級(jí)資料，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank分析確定生存率差別，Cox風(fēng)險(xiǎn)比率回歸模型進(jìn)行多變量生存分析。SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所有數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化結(jié)果表明，α-catulin在原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞質(zhì)和膜上高表達(dá)，而在復(fù)層扁平上皮和異型增生中呈低表達(dá)（圖1）。復(fù)層扁平上皮、異型增生、原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中α-catulin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為11.2%（17/152）、51.8%（251/485）、58.3%（28/48），見表1。根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度和頻率，頭頸部原發(fā)鱗癌與復(fù)層扁平上皮和異型增生中α-catulin表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中α-catulin表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

HNSCC惡性生物學(xué)行為各組間α-catulin表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2），包括性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期。

圖1 頭頸部鱗上皮、異型增生和鱗癌中α-catulin蛋白的表達(dá)Fig.1 α-catulin expression in squamous mucosa，dysplasia and carcinoma of head and neck

表1 頭頸部鱗癌發(fā)生和發(fā)展過程中α-catulin蛋白表達(dá)Tab.1 α-catulin expression in carcinogenesis of head and neck squamous cell carcinomas

表2 α-catulin蛋白表達(dá)與頭頸部鱗癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between α-catulin expression and clinicopathological characteristics of head and neck squamous cell carcinomas

本研究隨訪了381例HNSCC患者，隨訪時(shí)間7～96個(gè)月（中位生存時(shí)間28.8個(gè)月），根據(jù)α-catulin蛋白表達(dá)繪制HNSCC患者的生存曲線（圖2），Kaplan-Meier單變量生存分析顯示α-catulin表達(dá)缺失組和陽(yáng)性表達(dá)組中HNSCC整體或無病生存率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Cox風(fēng)險(xiǎn)比率回歸多變量分析結(jié)果顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期是HNSCC整體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05，表3）。

圖2 α-catulin蛋白表達(dá)與頭頸部鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Correlation between α-catulin expression status and the prognosis of patients with head and neck squamous carcinoma

表3 頭頸部鱗癌臨床病理特征的多變量生存分析Tab.3 Multivariate analysis of clinicopathological variables for the survival with head and neck squamous cell carcinoma

3 討論

人類α-catulin基因（CTNNAL1）定位于9q31-32，含有734個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白分子量82 kDa，其N端區(qū)域包含β-catenin、talin和α-actinin蛋白結(jié)合位點(diǎn)。α-catenin C端同源區(qū)兩親性螺旋含有緊密連接蛋白ZO-1和細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的潛在結(jié)合位點(diǎn)［6，7］。

α-catulin在炎癥、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架重建、衰老、癌癥進(jìn)展和EMT中是重要的蛋白。為闡明αcatulin表達(dá)的作用，我們對(duì)組織芯片進(jìn)行了免疫組化研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從頭頸部鱗狀上皮-異型增生-鱗癌的演變過程中α-catulin過表達(dá)，提示α-catulin表達(dá)上調(diào)參與頭頸部復(fù)層扁平上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程。有文獻(xiàn)報(bào)道［4，8］，黑色素瘤細(xì)胞中a-catulin表達(dá)高于黑色素細(xì)胞，乳腺癌中CTNNAL1mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)的正常乳腺組織。Fan等［9］發(fā)現(xiàn)α-catulin在惡性頭頸部鱗癌和小鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌模型中的腫瘤侵襲前沿和轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中高表達(dá)。因此，這些數(shù)據(jù)表明α-catulin過度表達(dá)可能作為HNSCC發(fā)生的潛在分子標(biāo)志。雖然有報(bào)道［9］表明α-catulin與腫瘤大小、鱗癌TNM分期呈正相關(guān)，但是本研究結(jié)果并沒有顯示α-catulin表達(dá)與HNSCC惡性生物學(xué)行為有關(guān)，原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中α-catulin表達(dá)也未見差異。然而，伴有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌中CTNNAL1 mRNA表達(dá)水平高于未伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例。單因素生存分析顯示，α-catulin蛋白表達(dá)與其HNSCC患者的整體和無病率無關(guān)，多變量分析表明遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期是HNSCC患者總生存的獨(dú)立預(yù)后因素。以上結(jié)果表明，用α-catulin表達(dá)作為HNSCC惡性生物學(xué)行為和不良預(yù)后的分子標(biāo)志需慎重。

總之，頭頸部鱗狀上皮-異型增生-鱗癌的發(fā)生過程中α-catulin表達(dá)上調(diào)，提示其過表達(dá)參與鱗狀上皮惡變過程。此外，α-catulin表達(dá)與HNSCC的惡性生物學(xué)行為和不良預(yù)后無明顯相關(guān)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期是HNSCC整體生存的獨(dú)立預(yù)后因素。

［1］Satpute PS，Hazarey V，Ahmed R，et al.Cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma：a review［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（10）：5579-5587.

［2］Kreiseder B，Orel L，Bujnow C，et al.α-Catulin downregulates E-cadherin and promotes melanoma progression and invasion［J］.Int J Cancer，2013，132（3）：521-530.

［3］Liang CH，Chiu SY，Hsu IL，et al.α-Catulin drives metastasis by activating ILK and driving an αvβ3 integrin signaling axis［J］.Cancer Res，2013，73（1）：428-438.

［4］Kreiseder B，Holper-Schichl YM，Muellauer B，et al.Alpha-catulin contributes to drug-resistance of melanoma by activating NF-κB and AP-1［J］.PLoS One，2015，10（3）：e0119402.

［5］Kumada T，Tsuneyama K，Hatta H，et al.Improved 1-h rapid immunostaining method using intermittent microwave irradiation：practicability based on 5 years application in Toyama Medical and Pharmaceutical University Hospital［J］.Mod Pathol，2004，17（9）：1141-1149.

［6］Kreiseder B，Holper-Schichl YM，Muellauer B，et al.Alpha-catulin contributes to drug-resistance of melanoma by activating NF-κB and AP-1［J］.PLoS One，2015，10（3）：e0119402.

［7］Xiang Y，Qin XQ，Liu HJ，et al.Identification of transcription factors regulating CTNNAL1 expression in human bronchial epithelial cells［J］.PLoS One，2012，7（2）：e31158.

［8］Tkés AM，Szász AM，Juhász E，et al.Expression of tight junction molecules in breast carcinomas analysed by array PCR and immunohistochemistry［J］.Pathol Oncol Res，2012，18（3）：593-606.

［9］Fan LC，Chiang WF，Liang CH，et al.α-Catulin knockdown induces senescence in cancer cells［J］.Oncogene，2011，30（23）：2610-2621.

（編輯 裘孝琦）

The Clinicopathological and Prognostic Significance of α-catulin Expression in Head Neck Squamous Cell Cancers

QIU Bo1，ZHANG Zhuo2，SHEN Dao-fu3，YANG Xue-feng3，ZHENG Hua-chuan3，TAKANO Yasuo4，HUANG Ke-qiang1

（1.Department of Stomatology，The Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Department of Stomatology，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；3.Cancer Center，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；4.Kanagawa Cancer Center，Yokohama 241-0815，Japan）

ObjectiveRho signaling component α-catulin，is a cytoskeletal linker protein and plays an important role in apoptotic and senescence resistance，cytoskeletal reorganization，mobility，invasion and epithelial to mesenchymal transition（EMT）of cancer cells.MethodsHere，we examined α-catulin expression in squamous epithelium，dysplasia and cancer of head and neck on tissue microarrays by immunostaining.Its expression was compared with clinicopathological parameters and survival rate of cancers.ResultsIt was found that α-catulin expression level was significantly higher in primary cancers than that in normal squamous epithelium and dysplasia（P＜0.05），but not significantly correlated with aggressive behaviors or adverse prognosis of HNSCC patients（P＞0.05）.Cox′s proportional hazard model indicated that distant metastasis and TNM staging were independent prognostic factors for overall survival of the patients with head and neck squamous carcinoma（HNSCC，P＜0.05）.ConclusionThese findings suggested that up-regulated expression of α-catulin protein may play an important role in the pathogenesis of HNSCC，which might be employed as a potential marker for tumorgenesis of HNSCCs.

head and neck squamous cell carcinoma；α-catulin；pathogenesis；progression；prognosis

R739

A

0258-4646（2015）12-1079-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81172371；81472544）；遼寧省教育廳優(yōu)秀人才計(jì)劃（LJQ2014093）；遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015408001）；遼寧省自然科學(xué)基金（2015020326）

邱波（1987-），女，醫(yī)師，碩士.

黃克強(qiáng)，E-mail：hkq9@163.com

2015-05-11

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