自體脂肪干細(xì)胞移植治療2型糖尿病的安全性及有效性

張新，周玉紅，白云

（遼河油田總醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 盤錦 124010）

自體脂肪干細(xì)胞移植治療2型糖尿病的安全性及有效性

張新，周玉紅，白云

（遼河油田總醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 盤錦 124010）

目的探討自體脂肪干細(xì)胞（ADSCs）移植治療2型糖尿病的安全性和有效性。方法培養(yǎng)自體ADSCs，并進(jìn)行鑒定。將2型糖尿病患者48例分為2組：A組（n=24）行ADSCs移植聯(lián)合常規(guī)治療，B組（n=24）行常規(guī)治療。隨訪觀察15個(gè)月，分析2組患者治療時(shí)和治療后3、6、12、15個(gè)月的空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2h-PGh）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、空腹C肽（FC-P）、C肽曲線下面積（AUCC）、胰島素劑量、不良反應(yīng)的情況。結(jié)果培養(yǎng)的ADSCs符合自體臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。與治療前相比，2組患者FPG、2h-PGh和HbA1c都有明顯降低，且A組降低更顯著；A組在FC-P、AUCC和胰島素用量方面的改善明顯優(yōu)于B組。在干細(xì)胞治療過程中無明顯不良反應(yīng)。結(jié)論采用自體ADSCs移植可以安全有效地治療2型糖尿病。

2型糖尿??；自體脂肪干細(xì)胞；移植；安全性和有效性

糖尿病已成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，且其中90%以上為2型糖尿?。?］。目前，臨床上治療2型糖尿病主要是通過飲食、運(yùn)動(dòng)、藥物和注射胰島素治療，但常常無法取得滿意的效果。近年來，隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，成體干細(xì)胞尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC），因具有取材方便、多向分化和自我更新等特點(diǎn)，被部分研究者用于2型糖尿病的臨床治療，并取得了較好的短期療效，為治愈2型糖尿病帶來了希望［2，3］。本研究將人體儲(chǔ)量大、干細(xì)胞獲得率較高的自體脂肪干細(xì)胞（autologous adipose-derived stem cells，ADSCs）用于2型糖尿病患者的自體移植，并通過隨訪觀察對(duì)其療效和安全性做出初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年9月至2013年6月于我院就診的2型糖尿病患者48例，采用單盲實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為A組和B組，每組24例。A組行干細(xì)胞移植聯(lián)合常規(guī)治療，B組單純行常規(guī)治療，2組常規(guī)治療方案一致。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)討論通過，患者知情同意。本研究符合赫爾辛基宣言和國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委關(guān)于干細(xì)胞臨床研究的管理辦法。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1999年WHO關(guān)于糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)和分型標(biāo)準(zhǔn)；年齡16～65歲，性別不限；服用藥物或注射胰島素控制血糖。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心、肝、腎功能不全；消耗性疾??；其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；有血液系統(tǒng)疾病或出血傾向；發(fā)生嚴(yán)重不良事件或不能耐受者。

1.2 ADSCs移植

ADSCs培養(yǎng)：從患者腹部取脂肪組織，用Ⅳ型膠原酶（Sigma公司，美國(guó)）消化后，離心。將收集到的有核細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液（Gibco公司，美國(guó)）接種到6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；48 h后，觀察細(xì)胞貼壁，此后每隔3 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行1∶3傳代。

ADSCs鑒定：（1）用倒置顯微鏡觀察記錄ADSCs形態(tài)；（2）用MTT方法檢測(cè)ADSCs接種后第1、2、3、5、6、7天細(xì)胞存活率，并繪制生長(zhǎng)曲線；（3）用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs表面標(biāo)記CD105、CD90、CD73和CD34、CD45、HLA-DR的表達(dá)量；（4）用成骨、成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)ADSCs向骨和脂肪2個(gè)方向分化，并分別用茜素紅和油紅O染液進(jìn)行染色后在顯微鏡下拍照，以檢測(cè)ADSCs多向分化能力；（5）檢測(cè)移植前ADSCs存活率和內(nèi)毒素。

ADSCs移植：培養(yǎng)的ADSCs收獲后用生理鹽水重懸，按1×107/kg體質(zhì)量進(jìn)行靜脈回輸，移植后患者留院觀察4 h。

1.3 療效觀察判定方法及安全性評(píng)價(jià)

記錄患者性別、年齡、病程、煙酒史、身高和治療前后的體質(zhì)量等一般資料，并計(jì)算體重指數(shù)（body mass index，BMI）=體質(zhì)量（kg）/身高2（m2）。實(shí)驗(yàn)室檢查治療前后2組患者的空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG），餐后2 h血糖（2 h postprandial blood glucose，2h-PGh），糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c），空腹C肽（fasting C-peptide，F(xiàn)CP），C肽曲線下面積（area under curve for C-peptide，AUCC）。AUCC=0.5×FC-P0 h+FC-P0.5 h+FC-P1 h+FC-P2 h+0.5×FC-P3 h；胰島素劑量。觀察移植后及隨訪過程中患者的不良反應(yīng)。

1.4 應(yīng)急處理

培養(yǎng)過程中，若發(fā)現(xiàn)污染則立即廢棄細(xì)胞，重新取患者脂肪組織進(jìn)行培養(yǎng)。若質(zhì)檢時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)量不過關(guān)，重新復(fù)蘇擴(kuò)增培養(yǎng)，或重新取患者脂肪組織進(jìn)行培養(yǎng)。ADSCs治療基本無不良反應(yīng)，細(xì)胞回輸后患者出現(xiàn)寒戰(zhàn)、低熱（體溫37.5～38.5℃）的概率很低，可臨床觀察24 h，基本會(huì)自行消退。不退熱的情況下，采用酒精擦拭等方法進(jìn)行降溫即可。

1.5 隨訪

移植治療后每2周由專人對(duì)患者進(jìn)行電話隨訪，詢問每位患者血糖控制和胰島素使用情況，并根據(jù)患者血糖控制情況適當(dāng)調(diào)整胰島素劑量?；颊咴谝浦埠?、6、12、15個(gè)月時(shí)來院復(fù)診，并進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室檢查。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

比較2組患者的性別、年齡、煙酒史、BMI、病程，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2組具有可比性。見表1。

表1 一般臨床資料比較Tab.1 Comparison of the basic clinical data of the two groups

2.2 ADSCs鑒定

2.2.1 ADSCs形態(tài)：原代培養(yǎng)的細(xì)胞接種后24 h即可見部分細(xì)胞貼壁，并逐漸伸展成為紡錘狀。經(jīng)換液后，貼壁細(xì)胞主要為ADSCs，呈長(zhǎng)梭形成纖維細(xì)胞樣。7～10 d時(shí)細(xì)胞基本貼滿孔板底部，細(xì)胞扁平，呈魚群狀、旋渦狀整齊排列。傳代培養(yǎng)的ADSCs生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)與原代相似。見圖1。

圖1 ADSCs細(xì)胞形態(tài)Fig.1 The morphology of ADSCs

2.2.2 ADSCs生長(zhǎng)曲線：將第3代ADSCs種于96孔板，檢測(cè)細(xì)胞活性，讀取吸光度值（OD值），繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示：細(xì)胞在接種后最初2 d處于生長(zhǎng)潛伏期，第3～6天處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6天達(dá)峰值，之后細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，平均5～6 d傳代1次。見圖2。

圖2 ADSCs生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of ADSCs

2.2.3 ADSCs多向分化能力：用成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)ADSCs，行茜素紅或油紅O染色，光鏡下觀察并拍照。成骨誘導(dǎo)后，可見部分細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槎嘟切危?xì)胞聚集，表面有一層分泌物，茜素紅染色呈陽性。成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸收縮變短，細(xì)胞內(nèi)有脂滴出現(xiàn)，經(jīng)油紅O染色，可見細(xì)胞內(nèi)有大量的脂質(zhì)沉積，被染成紅色。觀察發(fā)現(xiàn)P3代ADSCs可向中胚層來源的2個(gè)以上方向分化。見圖3。

圖3 ADSCs誘導(dǎo)分化Fig.3 The differentiation of ADSCs

2.2.4 ADSCs表面標(biāo)記檢測(cè)：結(jié)果顯示，P3代ADSCs呈CD105、CD90和CD73陽性，陽性率＞98%；CD45、CD34和HLA-DR陰性，陽性率＜2%。見圖4。

2.2.5 移植前ADSCs存活率和內(nèi)毒素檢測(cè)：臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，用于移植的ADSCs細(xì)胞存活率均＞95%。鱟試劑凝膠法內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果顯示內(nèi)毒素≤5 EU/mL，符合臨床使用標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 移植前后各項(xiàng)觀察指標(biāo)的變化

如表2所示：與治療前相比，B組患者治療后3個(gè)月FPG水平明顯改善（P＜0.01），A組患者雖有改善但不明顯，2組患者治療后3個(gè)月2h-PGh和HbA1c含量均有明顯改善（P＜0.05）；治療后6、12、15個(gè)月，2組患者FPG、2h-PGh和HbA1c含量較治療前均有明顯改善（P＜0.01）；A組治療后3個(gè)月2h-PGh改善效果明顯優(yōu)于B組（P＜0.01），治療后6個(gè)月HbA1c改善效果明顯優(yōu)于B組（P＜0.05），治療后12和15個(gè)月FPG、2h-PGh、HbA1c改善效果均明顯優(yōu)于B組（P＜0.05）。治療后12個(gè)月，B組患者FC-P含量較治療前明顯降低（P＜0.05）；而A組患者在治療后隨訪的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)FC-P含量均較治療前有明顯提高（P＜0.05），且與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)B組患者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。B組患者AUCC在隨訪的各時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化，而A組患者AUCC在治療后3、12、15個(gè)月均有明顯增加（P＜0.05），且與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)B組患者AUCC相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，B組患者胰島素用量有增加的趨勢(shì)，但差異不明顯，而A組患者胰島素用量逐漸減少，且A組各時(shí)間點(diǎn)與治療前及與B組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖4 ADSCs流式檢測(cè)Fig.4 The flow cytometric analysis of ADSCs

表2 2組各項(xiàng)指標(biāo)的變化Tab.2 Changes in the clinical data of the two groups

2.4 不良反應(yīng)

在治療和隨訪過程中，A組患者未出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹等過敏反應(yīng)和其他不良反應(yīng)。

3 討論

近年來，全球2型糖尿病患病率逐年增加，由于其并發(fā)癥具有高致殘致死率，嚴(yán)重影響人類健康。目前，臨床上治療2型糖尿病仍處于胰島素治療、運(yùn)動(dòng)加飲食治療等臨床控制階段，迫切需要有突破臨床控制的治療方式的出現(xiàn)。干細(xì)胞移植作為一種新興的治療方式，日益受到人們的關(guān)注。國(guó)內(nèi)外學(xué)者用臍血干細(xì)胞［4，5］、外周血干細(xì)胞［6］、骨髓來源的MSC［7～12］、臍帶來源的MSC［13］等治療2型糖尿病，均在控制血糖、修復(fù)胰島分泌功能方面取得了更佳效果。到2015年10月10日為止，在互聯(lián)網(wǎng)上（http：// www.clinical.gov）能查到91項(xiàng)關(guān)于干細(xì)胞治療2型糖尿病的臨床研究。本研究采用具有人體儲(chǔ)量大、易于采集培養(yǎng)、分化增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的ADSCs進(jìn)行移植，觀察其治療2型糖尿病的安全性和有效性。結(jié)果顯示，在ADSCs移植后及隨訪過程中，患者未出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹等不良反應(yīng)及其他并發(fā)癥，說明ADSCs是治療2型糖尿病的安全的新方法，具有一定的臨床可行性。

本研究結(jié)果顯示：培養(yǎng)的ADSCs形態(tài)正常、一致性好，具有可向中胚層來源的2個(gè)方向分化和增殖能力強(qiáng)等MSCs的特性，且細(xì)胞存活率高、無菌、無支原體，符合成體干細(xì)胞的臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)［15］。本研究采用靜脈回輸?shù)姆椒?，利用干?xì)胞的“歸巢”特性，期望能夠獲得如Gitelman等［16］實(shí)驗(yàn)中骨髓干細(xì)胞促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生和修復(fù)胰島分泌功能的結(jié)果。結(jié)果顯示，在2型糖尿病患者平均血糖控制方面，ADSCs移植聯(lián)合常規(guī)治療比僅用常規(guī)治療有明顯優(yōu)勢(shì)，聯(lián)合治療能使胰腺β細(xì)胞的分泌功能增強(qiáng)，而僅用常規(guī)治療則不能，甚至有可能使胰腺β細(xì)胞的分泌功能降低；聯(lián)合治療能在很好地控制血糖的基礎(chǔ)上，降低患者胰島素用量，并有7例患者脫離了胰島素，而僅用常規(guī)治療則需增加胰島素用量才能維持患者的血糖水平。以上結(jié)果提示，ADSCs移植聯(lián)合常規(guī)治療效果明顯優(yōu)于單純常規(guī)治療，因此，該方法是一種可行性高、安全有效的治療2型糖尿病的方式。

干細(xì)胞治療技術(shù)是生物治療領(lǐng)域的一種新興項(xiàng)目，目前許多治療作用的確切機(jī)制尚不完全清楚，且缺少多中心、大樣本的研究數(shù)據(jù)和干細(xì)胞移植的規(guī)范化操作，因此，對(duì)于干細(xì)胞移植治療2型糖尿病還需進(jìn)一步深入研究和探討。

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（編輯 王又冬）

Efficacy and Safety of Autologous Adipose-derived Stem Cells Transplantation in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus

ZHANGXin，ZHOUYu-hong，BAIYun

（Department of Endocrinology，Liaohe Oilfield General Hospital，Panjin 124010，China）

ObjectiveTo evaluate the clinical efficacy and safety of ADSCs infusion in patients with type 2 diabetes mellitus（T2DM）.MethodsAutologous ADSCs were cultured and identified.Totally 48 cases of type 2 diabetes patients were divided into two groups：24 cases in A group received ADSCs and conventional treatment，while the other24 cases in B group received conventional treatment.With 15 months′follow-up，F(xiàn)PG，2h-PGh，HbA1c，F(xiàn)C-P，AUCC，insulin medication changes and security on post-treatment3，6，12 and 15 months were calculated.ResultsThe ADSCs which cultured met the clinical application of standards.FPG，2h-PGh and HbA1c in both groups were significantly decreased，and the values in A group were more impressive than B.There were significant improvement in FC-P，AUCC and insulin of A group compared with B group.There was not treatment related adverse events.ConclusionThe clinical data demonstrate that the treatment with ADSCs can improve metabolic control and beta cell function in patients with T2DM.Moreover，the safety oft he treatment method was considerable.

type 2 diabetes mellitus；autologous adipose-derived stem cells；transplantation；efficacy and safety

R5

A

0258-4646（2015）12-1137-05

張新（1979-），女，主治醫(yī)師，碩士.

E-mail：xixi_1979@163.com

2015-04-08

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