代謝組學(xué)技術(shù)及其在茶葉研究中的應(yīng)用

周瓊瓊，孫威江，2*

1 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院;2福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福州 350002

隨著人類基因組測序工作的完成，生命科學(xué)研究跨入了后基因組時代，基因功能的研究逐漸成為熱點，隨之出現(xiàn)了一系列的“組學(xué)”研究，包括研究轉(zhuǎn)錄過程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)、研究某個生物體系中所有蛋白質(zhì)及其功能的蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)及研究代謝產(chǎn)物的變化及代謝途徑的代謝組學(xué)(metabolomics 或metabonomics)。

1 代謝組學(xué)概述

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的系統(tǒng)生物學(xué)的一個新的分支，是通過考察生物體系受外界刺激或擾動后其代謝產(chǎn)物的變化來研究生物體系代謝途徑的一門科學(xué)［1，2］。它所關(guān)注的是相對分子質(zhì)量為1000 以下的小分子物質(zhì)，其任務(wù)在于檢測和量化生物體內(nèi)各種代謝物組分與含量及其變化規(guī)律，揭示生命現(xiàn)象和過程［3］。它是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)，從而對生物體的代謝產(chǎn)物進行定性定量分析。代謝組學(xué)的概念自上世紀90年代提出后便迅速發(fā)展，并滲透到科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，在臨床研究、藥物研發(fā)與毒理安全性評價、天然藥物質(zhì)量控制、食品營養(yǎng)與食品品質(zhì)鑒別、微生物和植物代謝、功能基因組學(xué)等方面蓬勃發(fā)展，取得了巨大的進展［4-8］。

代謝組學(xué)的研究可追溯到上世紀70年代基于代謝譜的分析(metabolic profiling)，由Hornings 引入這一概念［9，10］，最初代謝輪廓分析的定義為描述與生物體代謝分析相關(guān)的代謝物的代謝模式的多組分分析的方法［10］。研究者主要是采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對人體代謝產(chǎn)物如類固醇、有機酸及其生物體液中藥物的代謝物進行定性、定量分析及對疾病進行分析和診斷，這種在臨床上利用代謝譜分析診斷有關(guān)疾病的方法一直沿用至今，開創(chuàng)了對復(fù)雜樣品進行代謝輪廓分析的先河。80年代，人們開始應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)和核磁共振(NMR)的技術(shù)來進行代謝輪廓的分析［2］。90年代后，代謝輪廓分析技術(shù)一直平穩(wěn)發(fā)展，研究內(nèi)容主要集中于藥物在體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)化等方面，其間Sauter等率先將代謝組分析引入植物系統(tǒng)診斷［11］，這種基于代謝組分析來研究外界因素對生物功能影響的研究思路隨即被人們認可。Nicholson［1］研究小組于1999年首先提出代謝組學(xué)(metabonomics)的概念，其主要以核磁共振技術(shù)研究人或動物在疾病作用下代謝產(chǎn)物的變化情況，應(yīng)用于疾病的早期診斷和治療等相關(guān)領(lǐng)域，使代謝組學(xué)得到了極大的充實。2000年，F(xiàn)iehn［12］等提出了另一種代謝組學(xué)(metabolomics)的概念，全面、定量分析生物體系中所有代謝物，并將其應(yīng)用于植物學(xué)的研究，將生物體的代謝產(chǎn)物和生物基因的功能聯(lián)系起來，指出每種基因型都具有一種獨特的代謝輪廓，代謝組學(xué)作為一種分析工具擴展和增強了已存在的功能基因組學(xué)的研究力量。至此形成了當(dāng)前代謝組學(xué)的兩大主流領(lǐng)域metabonomics 和metabolomics。Metabonomics是評價生物體對病理生理刺激或基因修飾產(chǎn)生的代謝物質(zhì)的質(zhì)和量的動態(tài)變化的研究，一般以細胞或者動物的體液或組織為研究對象［13］，主要用于藥物研究和疾病診斷等領(lǐng)域;Metabolomics 是代謝控制論提升的學(xué)科，主要用于植物和微生物領(lǐng)域。現(xiàn)在這兩個定義已經(jīng)模糊化，沒有特別的區(qū)分［14］。

2 代謝組學(xué)的研究技術(shù)

代謝組學(xué)研究一般包括樣品采集和制備、代謝組數(shù)據(jù)的采集和預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、目標(biāo)物識別和途徑分析等步驟。

2.1 分析技術(shù)平臺

樣品的采集和制備是代謝組學(xué)研究的初始步驟，也是最重要的步驟之一。代謝產(chǎn)物通常用水或有機溶劑(如甲醇、石油醚等)提取，經(jīng)過萃取、層析、親和色譜等方法以獲得水相提取物和有機相提取物，然后運用色譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或核磁共振等技術(shù)檢測提取物中代謝物的種類和含量，獲得大量多維復(fù)雜數(shù)據(jù)，之后采用化學(xué)計量學(xué)方法進行數(shù)據(jù)分析，識別出有顯著變化的代謝標(biāo)志物，從而研究代謝途徑和變化規(guī)律，闡明生物體的反應(yīng)機制。由于代謝產(chǎn)物和生物體系的復(fù)雜性，至今為止，沒有一種能夠適合所有代謝產(chǎn)物的分析技術(shù)，大多采用聯(lián)用技術(shù)和多個方法的綜合分析。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、核磁共振(NMR)、紅外光譜等分離分析手段及其組合都出現(xiàn)在代謝組學(xué)的研究中，其中全球應(yīng)用最多的代謝組學(xué)分析手段為核磁共振(尤其是1H-NMR)和質(zhì)譜技術(shù)［15］。

質(zhì)譜技術(shù)具有較高的靈敏度和廣泛的適用性，基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)研究在藥物開發(fā)、臨床疾病、食品安全、植物學(xué)、微生物學(xué)、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用［16］。目前應(yīng)用最廣泛最有效的研究技術(shù)是氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)。

就GC-MS 分析技術(shù)而言，可將代謝物分為兩類:不需要化學(xué)衍生的揮發(fā)性代謝物和需要化學(xué)衍生的非揮發(fā)性代謝物。揮發(fā)性代謝物一般是熱穩(wěn)定、易揮發(fā)的化合物，非揮發(fā)性代謝物如氨基酸、脂肪酸等一般是極性強、揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的化合物需要進行適當(dāng)?shù)难苌D(zhuǎn)化為揮發(fā)性的物質(zhì)才能進行分析。GC-MS 的優(yōu)勢在于能夠提供較高的分辨率和檢測靈敏度，并且有可供參考、比較的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，可以方便地得到待分析代謝物的定性結(jié)果。

高效液相色譜更適合于高沸點、大分子和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析，由于已知的化合物大約有70%是不揮發(fā)的，因此液相色譜有著廣闊的應(yīng)用空間，與串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)用更是實現(xiàn)了對復(fù)雜基質(zhì)中結(jié)構(gòu)相似的化合物的分析，大大提高了分辨率和精確測定的能力。隨后發(fā)展的超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用擴展了分析物的覆蓋率，可以獲得靈敏度比HPLC-MS 大有改善的分離結(jié)果，獲得更多、質(zhì)量更好的信息。多維氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用的發(fā)展，對復(fù)雜體系中的目標(biāo)物分析有著突出的優(yōu)勢。因此這兩種技術(shù)可以檢測包括糖類、氨基酸、有機酸、脂肪酸和芳胺，以及大量次級代謝物在內(nèi)的數(shù)百種化學(xué)性質(zhì)不同的化合物［17］，這是其它任何一項技術(shù)無法比擬的。

核磁共振技術(shù)(NMR)是一種基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生能級躍遷的譜學(xué)技術(shù)。生命科學(xué)領(lǐng)域中常用的是氫譜(1H NMR)、碳譜(13C NMR)及磷譜(31P NMR)3 種，可用于體液或組織提取液和活體分析兩大類，其中以1H NMR 應(yīng)用最為廣泛［18］。NMR 技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品的非破壞性、非選擇性分析，不破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，無輻射損傷;可在一定的溫度和緩沖液范圍內(nèi)選擇實驗條件，可以進行實時和動態(tài)的監(jiān)測;樣品處理簡單，分析速度快［19］。NMR 技術(shù)的不足在于靈敏度低、分辨率不高，動態(tài)范圍有限，很難同時測定生物體系中共存的豐度相差較大的代謝物。但隨著近年新發(fā)展的魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)、多維核磁共振技術(shù)以及LC-NMR 聯(lián)用，使基于NMR 技術(shù)的代謝組學(xué)研究日趨完善。

2.2 數(shù)據(jù)分析平臺

代謝組學(xué)技術(shù)對樣品進行分析后得到的是大量的、多維的分析數(shù)據(jù)，需要借助于化學(xué)計量學(xué)方法進行數(shù)據(jù)的分析與解釋。目前數(shù)據(jù)分析常用的兩類算法是基于尋找模式的非監(jiān)督方法和有監(jiān)督方法。

聚類分析(CA)是一種非常實用的多元統(tǒng)計方法，是將類似的樣本聚在一起，從而獲得分類，不需要事先確定樣本的類型歸屬，沒有可供學(xué)習(xí)利用的訓(xùn)練樣本，因此稱為非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。主要包括主成分分析(PCA)、非線性映射(NLM)和分級聚類法(HCA)等。

有監(jiān)督的模式識別方法是利用一組已知分類的樣本作為訓(xùn)練集，利用計算機獲取分類的基本模型，進而利用這一模型對未知樣本進行類型判斷。常用的方法有K 最鄰近法(K-NN)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、軟獨立建模分類法(SIMCA)和人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)(ANN)分析等數(shù)據(jù)分析方法。近年來，由于支持向量機(SVM)對于數(shù)據(jù)高維的特點不敏感，因此特別適合于處理樣本數(shù)量較少而維數(shù)很高的生物數(shù)據(jù)，因此在代謝組學(xué)后期數(shù)據(jù)的判別分析中也應(yīng)用較多。

3 代謝組學(xué)在茶葉研究中的應(yīng)用

植物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的一個重要分支。植物代謝組學(xué)是對植物的某一組織或細胞在特定生理時期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物同時進行定性和定量分析［20］。得益于高通量檢測技術(shù)的日益成熟和成本的降低，植物代謝組學(xué)的應(yīng)用也從描述單一代謝途徑走向與其它組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，通過基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組對傳統(tǒng)遺傳學(xué)和生物表型進行直接聯(lián)系，并將現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫相關(guān)聯(lián)，圍繞特定的生物學(xué)問題，共同揭示植物生命活動的奧秘。

伴隨著茶葉貿(mào)易全球化，各區(qū)域茶葉消費呈現(xiàn)多元化態(tài)勢，消費者對茶葉的質(zhì)量與安全追求日益提高，如何利用新的科學(xué)研究方法(如代謝組學(xué)、基因組學(xué)等)，不斷的提高茶葉工藝水平，提高茶葉質(zhì)量，是現(xiàn)如今茶學(xué)科研工作者的重要課題。

3.1 茶樹生長發(fā)育的研究

不同的栽培管理，不同的生長發(fā)育階段影響茶樹本身理化成分的代謝方式，進而改變茶葉的品質(zhì)。Ku KM［21］等利用代謝組學(xué)方法研究了遮蔭處理下茶樹次級代謝產(chǎn)物的變化以及抗氧化活性的能力。Lee［22，23］等利用1H-NMR 和多元分析研究同一品種不同采摘位置茶葉和莖的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)隨著茶樹葉片生長發(fā)育，茶氨酸、咖啡堿和沒食子酸水平上升，而兒茶素類、葡萄糖和蔗糖水平下降;茶莖則具有很高的茶氨酸水平和很低的兒茶素類水平，揭示了葉片和莖存在不同的代謝模式，合理利用茶葉和茶莖，可使產(chǎn)品的主要化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)合理;同樣，利用代謝組學(xué)方法探討了不同氣候條件下茶葉代謝產(chǎn)物的變化。郝亞利［24］基于代謝譜手段分析了不同光質(zhì)處理對茶鮮葉品質(zhì)形成的影響，監(jiān)測不同生育期茶鮮葉樣品中的氨基酸、兒茶素、生物堿和黃酮組分及其含量的動態(tài)變化。楊亦揚［25］等采用基于1H-NMR 的代謝組學(xué)非靶標(biāo)分析與高效液相色譜法進行的定量靶標(biāo)分析兩種方法，比較白天和夜晚所取不同施氮水平的茶樹新梢第2 葉的代謝產(chǎn)物差異，探討代謝組學(xué)研究方法應(yīng)用于茶葉品質(zhì)成分形成機理研究的可行性。由此說明，生長環(huán)境、栽培管理方式對植物的生長代謝是有很大影響的。

3.2 茶樹品種及產(chǎn)地溯源

茶葉種類繁多，種質(zhì)資源豐富，同一產(chǎn)地不同品種或同一品種不同茶地加工的茶葉品質(zhì)往往會有較大的差異，利用代謝組學(xué)分析手段對原料品種、產(chǎn)地等的溯源有利于維護市場秩序，防止以假亂真，促進與茶葉相關(guān)的農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)保護，從而為茶葉的地理標(biāo)志性保護提供依據(jù)。

李萬春［20］等采用衍生化GC-MS 方法，對福建省安溪縣境內(nèi)8 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的鐵觀音及其它三個烏龍茶品種(黃金桂、本山和毛蟹)進行代謝組學(xué)分析研究，通過化學(xué)計量學(xué)對數(shù)據(jù)進行處理、建模，確定茶葉的品種及產(chǎn)地，PCA 結(jié)果表明安溪縣境內(nèi)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的鐵觀音表型有明顯的差異，相鄰鄉(xiāng)鎮(zhèn)的茶葉代謝表型相似，為辨別安溪鐵觀音真?zhèn)蔚於嘶A(chǔ)。王麗鴛［26，27］等利用多元化學(xué)指紋圖譜方法對杭州、麗水和新昌三個地區(qū)以龍井43、群體種和迎霜品種加工制作的9 類扁形綠茶產(chǎn)品進行判別分析，結(jié)果表明同一品種不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地不同品種綠茶樣本指紋圖譜間存在顯著差異;同樣，對不同品種、不同產(chǎn)地的武夷巖茶進行了判別分析。成浩［28，29］等研究表明采用化學(xué)指紋圖譜方法結(jié)合判別技術(shù)對茶產(chǎn)品的產(chǎn)地屬性進行鑒別或驗證分析是可行的。周?。?0，31］等采用了近紅外光譜并結(jié)合PCA 和Fisher識別分類法，鑒定成品茶原料品種;之后，同樣以近紅外光譜分析技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合偏最小二乘模型組合分析實現(xiàn)對茶葉原料品種的鑒定與溯源。袁玉偉［32］等利用穩(wěn)定同位素和礦物多元素檢測結(jié)合PCA-LDA 法能進行茶葉產(chǎn)地溯源，對福建、山東、浙江等產(chǎn)地的茶葉進行判別，效果較好。Fernández-Cáceres［33］等結(jié)合線性判別分析(LDA)、ANN 等化學(xué)計量法初步研究了不同產(chǎn)地的綠茶、黑茶、速溶茶中Al、Ca、Ba 等12 種元素的含量差異與產(chǎn)地間的關(guān)系。Moreda-Pi?eiro［34］等利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測定來自不同國家茶葉中的微量金屬元素與產(chǎn)地土壤中微量元素，結(jié)合PCA，CA，LDA 和SIMCA 方法分析元素含量與原產(chǎn)地的相關(guān)性，進而判別茶葉產(chǎn)地。Fraser［35］等利用UPLC-MS 結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法對茶葉的產(chǎn)地、類型進行判別。

3.3 茶葉加工過程在線檢測

茶葉原料是茶葉品質(zhì)的基礎(chǔ)，而加工是關(guān)鍵。如今，絕大部分茶葉的加工過程主要依賴于經(jīng)驗豐富的做茶師傅，“看青做青”，沒有形成標(biāo)準(zhǔn)化，可復(fù)制的加工模式。對此，日本學(xué)者Daiki［36］于2011年采用傅立葉變換近紅外光譜(FT-NIR)光譜和偏最小二乘(PLS)回歸分析，以客觀的優(yōu)化日本蒸青綠茶的加工工藝。趙峰［37］等于2014年嘗試采用近紅外光譜技術(shù)實現(xiàn)對武夷巖茶精制過程的在線檢測，分別對武夷巖茶主要品質(zhì)成分即水分、咖啡因、茶多酚和粗纖維的含量分別建立近紅外定量分析模型并檢驗，滿足生產(chǎn)線上對武夷巖茶品質(zhì)組分快速測定的要求。

3.4 茶類判別分析

不同茶類的快速準(zhǔn)確甄別是當(dāng)前茶葉領(lǐng)域亟待解決的重要課題，也是茶葉國際標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分。

李萬春［20］等用衍生化GC-MS 方法還對綠茶、白茶、烏龍茶(鐵觀音和水仙)和紅茶進行代謝組學(xué)研究，用主成分分析對數(shù)據(jù)進行處理，PCA 結(jié)果表明不同發(fā)酵程度的四種茶葉代謝表型差異顯著。蔡健榮［38］等采用近紅外光譜結(jié)合K 最近鄰法(KNN)模式識別方法對茶葉進行識別與分類，正判率高。陳全勝［39］等收集來自全國的紅茶、綠茶、烏龍茶等共150 個樣品，采集近紅外光譜結(jié)合SVM 計量方法對三類茶葉分別建模，正判率較高，達到快速判別分析茶類，說明代謝組學(xué)方法在茶類判別分析中同樣具有應(yīng)用潛力。

3.5 茶葉等級及質(zhì)量評價

我國六大茶類品種眾多，品質(zhì)各異，目前茶葉市場上的等級劃分存在很大的隨意性，等級的判別依然根據(jù)國標(biāo)GB/T 23776 以感官審評為主，主要依靠人的嗅覺、味覺、視覺和觸覺等進行茶類等級的快速區(qū)分，然而這種評價方法較難實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，審評結(jié)果只能相對而論。因此，代謝組學(xué)的興起為茶葉高效率、高精度的等級判別、質(zhì)量評價提供了一種科學(xué)手段。

在茶葉的等級判別方面，日本學(xué)者應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)所做的研究較多。日本學(xué)者［40］基于1H-NMR技術(shù)和多元分析(PCA、PLS)的代謝組學(xué)手段對日本綠茶進行質(zhì)量評價，可分離等級較好和較差的綠茶，鑒定出滋味標(biāo)記化合物。Tatsuhiko［41］等通過使用傅里葉變換近紅外光譜(FT-NIR)和代謝組學(xué)技術(shù)在線預(yù)測綠茶的質(zhì)量，指出5500—5200 cm-1的波長范圍與茶葉品質(zhì)有很高的相關(guān)性。同樣，Pongsuwan［42-44］等分別研究了利用不同的代謝組學(xué)手段評估茶葉質(zhì)量:采用GC-MS 和多變量數(shù)據(jù)分析結(jié)合評估綠茶的品質(zhì);采用熱裂解氣相色譜/質(zhì)譜法(PRGC/MS)來評估日本綠茶的質(zhì)量，這種技術(shù)不需要制備樣品或者衍生，快速、簡單、成本低;利用UPLC/TOF-MS 結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法分析綠茶中的代謝物和其質(zhì)量的關(guān)聯(lián)性，指出除了沒食子兒茶素，其它主要的兒茶素(包括表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯)是日本煎茶高等級的顯著標(biāo)志物。中國學(xué)者Lin［45］等采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和GC-MS技術(shù)分析龍井茶的香氣成分，建立模型，從而最終預(yù)測綠茶質(zhì)量。然而，茶葉的香氣成分在感官審評中占的比例為25%～35%，能否通過香氣質(zhì)量來評估茶葉質(zhì)量，還有待評估，不過這為茶葉等級的判別提供了一種新的研究思路。周小芬［46］等應(yīng)用近紅外光譜分析技術(shù)對大佛龍井茶進行品質(zhì)評價。

3.6 茶葉年份、季節(jié)的預(yù)測

Xu［47］等利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)多元方法，建立了區(qū)分的沱茶類型(未發(fā)酵的，發(fā)酵)和預(yù)測沱茶年份的模型。Xu［48］等利用代謝組學(xué)結(jié)合監(jiān)督模式識別方法預(yù)測茶葉生產(chǎn)的季節(jié)，即鑒定該茶葉是春茶或夏茶。

4 代謝組學(xué)技術(shù)在茶葉研究中的應(yīng)用前景

茶學(xué)是一門綜合科學(xué)涉及到多個學(xué)科、多種研究方法，包括生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、植物學(xué)、遺傳學(xué)、化學(xué)、食品營養(yǎng)學(xué)和經(jīng)濟學(xué)等。茶葉實現(xiàn)從田間到茶杯，涉及到諸多復(fù)雜的代謝產(chǎn)物的變化，影響茶葉最終質(zhì)量和品質(zhì)的因素眾多，如何把茶葉從品種選育、栽培、加工到最終產(chǎn)品作為一個整體，對其進行研究，是茶學(xué)發(fā)展的一個重要課題。代謝組學(xué)將茶葉原料質(zhì)量與安全的控制、栽培管理、工藝優(yōu)化、品質(zhì)評價等指標(biāo)整合，進行代謝產(chǎn)物研究，是一種行之有效的研究方法并在茶葉的研究方面可發(fā)揮巨大的作用。

代謝組學(xué)概念自提出到應(yīng)用至今已有將近20年的時間，發(fā)展之迅速，應(yīng)用之廣泛。由于代謝組處于系統(tǒng)生物學(xué)信息流的底端，是基因表達的最終產(chǎn)物，通過對生物代謝物的分析，能全面了解生物體在當(dāng)前生理階段或外界刺激下的真實反應(yīng)，從而更直觀的揭示生物體的遺傳背景和環(huán)境條件對生物體的決定作用。在茶學(xué)科研領(lǐng)域，關(guān)聯(lián)茶葉品質(zhì)的生物標(biāo)志物的獲取僅僅是代謝組學(xué)研究的初級目標(biāo)，如何將代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)庫與其他組學(xué)(基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué))的數(shù)據(jù)進行整合及構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝通路的動態(tài)變化規(guī)律是研究的最終目的。目前茶葉在代謝組學(xué)與其他組學(xué)結(jié)合的研究方面還相對薄弱，今后應(yīng)充分利用代謝組學(xué)為我們提供的大量植物生化表型的特征信息，通過代謝組學(xué)技術(shù)促進植物基因功能組學(xué)的研究工作，結(jié)合生物技術(shù)手段，生物信息學(xué)分析，加快茶葉品質(zhì)改良的進程。因此將多種研究方法和技術(shù)手段結(jié)合起來，尤其將功能基因組學(xué)與代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合，將是研究植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)的一條新途徑。

1 Nicholson JK，et al.Metabonomics:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.Xenobiotica，1999，29:1181-1189.

2 Xu GW (許國旺)，et al.Recent advances in metabonomics.Acta Acad Med Sin(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報)，2008，29:701-711.

3 Tang HR，Wang YL.Metabonomics:a revolution in progress.Prog Biochem Biophys，2006，33:401-407.

4 Wang TJ，et al.Metabolite profiles and the risk of developing diabetes.Nat Med，2011，17:448-453.

5 Cramer GR，et al.Water and salinity stress in grapevines:early and late changes in transcript and metabolite profiles.Funct integr genomic，2007，7:111-134.

6 Chen C，et al.LC-MS-based metabolomics in drug metabolism.Drug Metab Rev，2007，39:581-597.

7 Van Doorn M，et al.Evaluation of metabolite profiles as biomarkers for the pharmacological effects of thiazolidinediones in Type 2 diabetes mellitus patients and healthy volunteers.Brit J Clin Pharmacol，2007，63:562-574.

8 Christy AA，et al.The detection and quantification of adulteration in olive oil by near-infrared spectroscopy and chemometrics.Anal Sci，2004，20:935-940.

9 Horning EC，Horning MG.Human metabolic profiles obtained by GC and GC/MS.J Chromatogr Sci，1971，9:129-140.

10 Horning EC，Horning MG.Metabolic profiles:gas-phase methods for analysis of metabolites.Clin Chem，1971，17:802-809.

11 Sauter H，et al.Metabolic profiling of plants-a new diagnostic technique.Synthesis Chem Agrochem，1991，24:288-299.

12 Fiehn O，et al.Metabolite profiling for plant functional genomics.Nat Biotechnol，2000，18:1157-1161.

13 Yang J (楊軍)，et al.Metabonomics and its applications.Chin J Biotech(生物工程學(xué)報)，2005，21:1-5.

14 Lindon JC，et al.The handbook of metabonomics and metabolomics.Kidlington:Elsevier Press，2011.517-532.

15 Theodoridis GA，et al.Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling:a review.Anal Chim Acta，2012，711:7-16.

16 Gika HG，et al.Current practice of liquid chromatographymass spectrometry in metabolomics and metabonomics.J Pharm Biomed，2014，87:12-25.

17 Zhou QX (周秋香)，et al.Advances in metabonomics and its applications.Biotech Bull(生物技術(shù)通報)，2013，1:009.

18 Solanky KS，et al.Application of biofluid1H nuclear magnetic resonance-based metabonomic techniques for the analysis of the biochemical effects of dietary isoflavones on human plasma profile.Anal Biochem，2003，323:197-204.

19 Cao HT (曹紅婷).Preparation，storage and experimental conditions of biofluid samples for NMR based metabonomics.Xiamen:Xiamen University (廈門大學(xué))，MSc.2009.

20 Li WC(李萬春).Application of GC-MS in determinating different tea quality.Nanjing:Nanjing University of Science and Technology (南京理工大學(xué))，MSc.2012.

21 Ku KM，et al.Metabolomics analysis reveals the compositional differences of shade grown tea (Camellia sinensisL.).J Agric Food Chem，2009，58:418-426.

22 Lee JE，et al.Metabolic dependence of green tea on plucking positions revisited:A metabolomic study.J Agric Food Chem，2011，59:10579-10585.

23 Lee JE，et al.Geographical and climatic dependencies of green tea (Camellia sinensis)metabolites:a1H NMR-based metabolomics study.J Agric Food Chem，2010，(58):10582-10589.

24 Hao YL (郝亞利).Metabolic profiling reveals the effects of different light qualities on the quality formation of fresh tea(Camellia sinensis)leaves.Hefei:Anhui Agriculture University (安徽農(nóng)業(yè)大學(xué))，MSc.2010.

25 Yang YY (楊亦揚)，et al.Metabonomic analysis on the effects of different Nitrogen application rates and light/dark change on metabolism in tea leaves.J Tea Sci(茶葉科學(xué))，2013，33:491-499.

26 Wang LY (王麗鴛)，et al.Discriminant classification of Wuyi Yan tea based on multiple chemical fingerprint.J Tea Sci(茶葉科學(xué))，2010，30(2):83-88.

27 Wang LY (王麗鴛)，et al.A preliminary attempt to establish the digital multiple chemical fingerprints of green Tea.J Tea Sci(茶葉科學(xué))，2007，27:335-342.

28 Cheng H (成浩)，et al.Discriminant classification of green tea’s raw material cultivar based on multiple chemical fingerprint.Sci Agric Sin(中國農(nóng)業(yè)科學(xué))，2008.41:2413-2418.

29 Cheng H (成浩)，et al.Discriminant classification of production area of flatten-shaped green tea based on multiple chemical fingerprint.J Tea Sci(茶葉科學(xué))，2008，28(2):83-88.

30 Zhou J (周健)，et al.Recognition for raw material cultivar of manufactured tea with fisher discriminant classification with principal components analysis.Acta Optica Sin(光學(xué)學(xué)報)2009，29:1117-1121.

31 Zhou J (周健)，et al.Study on identification and traceability of tea material cultivar by combined analysis of multi-partial least squares models based on near infrared spectroscopy.Spectrosc Spect Anal(光譜學(xué)與光譜分析)，2010，10:2650-2653.

32 Yang YW (袁玉偉)，et al.Application of PCA-LDA method to determine the geographical origin of tea based on determination of stable isotopes and multi-elements.Acta Agric Nulc Sin(核農(nóng)學(xué)報).2003，27:47-55.

33 Fernández-Cáceres PL，et al.Differentiation of tea (Camellia sinensis)varieties and their geographical origin according to their metal content.J Agric Food chem，2001，49:4775-4779.

34 Moreda-Pi?eiro A，et al.The classification of tea according to region of origin using pattern recognition techniques and trace metal data.J Food Compos Anal，2003，16:195-211.

35 Fraser K，et al.Analysis of metabolic markers of tea origin by UHPLC and high resolution mass spectrometry.Food Res Int，2013，53:827-835.

36 Ono D，et al.Application of Fourier transform near-infrared spectroscopy to optimization of green tea steaming process conditions.J Biosci Bioeng，2011，112:247-251.

37 Zhao F (趙峰)，et al.Online quantitative determination of Wuyi Rock tea quality compounds by near infrared spectroscopy.Trans Chin Soc Agr Eng(農(nóng)業(yè)工程學(xué)報)，2014.30:269-277.

38 Cai JR (蔡健榮)，et al.Application of near infrared reflectance spectroscopy in identification of different classified tea.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2007，35:4083-4084.

39 Chen Q，et al.Feasibility study on identification of green，black and Oolong teas using near-infrared reflectance spectroscopy based on support vector machine (SVM).Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2007，66:568-574.

40 Tarachiwin L，et al.1H NMR based metabolic profiling in the evaluation of Japanese green tea quality.J Agric Food Chem，2007，55:9330-9336.

41 Ikeda T，et al.Prediction of Japanese green tea ranking by Fourier transform near-infrared reflectance spectroscopy.J Agric Food Chem，2007，55:9908-9912.

42 Pongsuwan W，et al.Prediction of Japanese green tea ranking by gas chromatography/mass spectrometry-based hydrophilic metabolite fingerprinting.J Agric Food Chem，2007，55:231-236.

43 Pongsuwan W，et al.High-throughput technique for comprehensive analysis of Japanese green tea quality assessment using ultra-performance liquid chromatography with time-offlight mass spectrometry (UPLC/TOF MS).J Agric Food Chem，2008，56:10705-10708.

44 Pongsuwan W，et al.Quality prediction of Japanese green tea using pyrolyzer coupled GC/MS based metabolic fingerprinting.J Agric Food Chem，2008，56:744-750.

45 Lin J，et al.Volatile profile analysis and quality prediction of Longjing tea (Camellia sinensis)by HS-SPME/GC-MS.J Zhejiang Univ Sci B，2012，13:972-980.

46 Zhou XF (周小芬)，et al.Study on quality evaluation of Dafo Longjing tea based on near infrared spectroscopy.Spectrosc Spect Anal(光譜學(xué)與光譜分析)，2012，32:2971-2975.

47 Xu L，et al.Predicting the age and type of tuocha tea by fourier transform infrared spectroscopy and chemometric data analysis.J Agric Food Chem，2011，59:10461-10469.

48 Xu W，et al.Discrimination of the production season of Chinese green tea by chemical analysis in combination with supervised pattern recognition.J Agric Food Chem，2012，60:7064-7070.