紅芪中微量元素與活性成分含量的相關(guān)性研究

強(qiáng)正澤，王 燕，李成義，李 碩，王明偉

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000

中藥紅芪為甘肅特產(chǎn)藥材之一，入藥部位為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrysHand.-Mazz.的干燥根［1］，甘肅武都米倉(cāng)山紅芪被引為“米倉(cāng)紅芪”，蘊(yùn)藏量豐富，資源優(yōu)勢(shì)待開(kāi)發(fā)。紅芪藥用歷史悠久，中醫(yī)臨床上用于治療氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷等癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅芪中毛蕊異黃酮、芒柄花素、多糖等是紅芪的活性成分，毛蕊異黃酮具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞［2］、興奮雌激素受體［3］等作用，芒柄花素具有抑制家兔小腸平滑肌的收縮［4，5］、保護(hù)缺氧損傷的成骨細(xì)胞［6］及植物雌激素樣［7］等作用，而紅芪多糖具有有抑制HepG-2 細(xì)胞增殖、防治2 型糖尿病胰島素抵抗及體外抗氧化能力等作用［8-10］，而學(xué)者對(duì)中藥中微量元素與成分的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，微量元素含量不僅影響某些中藥的藥性與藥效［11，12］，而且直接或間接的干預(yù)中藥中次生代謝產(chǎn)物的合成［13，14］，同時(shí)也影響了某些中藥的道地性［15］，已經(jīng)成為中藥質(zhì)量控制不可或缺的特征參數(shù)［16］，因此明確紅芪中微量元素含量與活性成分含量之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步揭示紅芪道地性及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。

本研究采用原子吸收光譜法、HPLC、紫外分光光度計(jì)法測(cè)定了甘肅不同產(chǎn)地板藍(lán)根中12 種微量元素和3 種活性成分的含量，分析了微量元素與活性成分含量之間的相關(guān)性，旨在為甘肅紅芪資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供合理依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 樣品來(lái)源

采集甘肅不同產(chǎn)區(qū)的紅芪樣品70 份，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院李成義教授鑒定，為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrysHand.Mazz.的干燥根，經(jīng)搓條晾曬后沖洗干凈晾干，備用。樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 紅芪樣品信息Table 1 Informations of Hedysari Radix samples

1.2 儀器

SOLAAR S-2 型原子吸收光譜儀(SOLAAR S-2)、SB450300 型電熱板(湖北英山國(guó)營(yíng)無(wú)限電元件廠)、101-2 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、BS 224 型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。實(shí)驗(yàn)所需量瓶等玻璃儀器，使用前均用鉻酸洗液浸泡24 h，后用自來(lái)水、去離子水沖洗干凈，50 ℃烘干備用。Agilent 1200 型高效液相色譜儀(安捷倫公司)，DAD 檢測(cè)器(美國(guó))、OHAUS Corporation DV SERIES 型電子天平(十萬(wàn)分之一，奧豪斯儀器有限責(zé)任公司)、AL 104 型電子天平(萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、FW200型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)、KQ-250TDB 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、HHS-4S 型電熱恒溫水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)、UV-2600 紫外分光光度計(jì)(日本島津)、220AC 型萬(wàn)用電爐(北京科偉永興儀器公司)、可調(diào)式電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)、C 型玻璃儀器氣流烘干器(河南省予華儀器有限公司)。

1.3 試劑

標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度1000 μg/mL)均購(gòu)于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心:Fe GSB 04-1726-20049，批號(hào):153029-1;Cu GSB 04-1725-2004，批號(hào):153040-1;Ca GSB 04-1720-2004，批號(hào):152030-2;Mn GSB 04-1736-2004，批號(hào):152021-2;Zn GSB 62025-90(3001)，批號(hào):07 092978;Mg GSB 04-1726-2004，批號(hào):152033-2;Cd GSB 04-1721-2004，批 號(hào):153008-2;Cr GSB 04-1722-2004，批號(hào):153001-1;Co GSB 04-1723-2004(a)，批號(hào): 153111;Na GSB 04-1738-2004，批號(hào):152034-3;Li GSB 04-17-2004，批號(hào):153002-1;Ni GSB 04-1740-2004，批號(hào):153034-1;K GSB 04-1733-2004，批號(hào):153004-1;高氯酸、濃硝酸均為分析純;毛蕊異黃酮對(duì)照品(購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào):MUST-13030602，純度為99 %);芒柄花素對(duì)照品(購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào):MUST-13050801，純度為99%);D-無(wú)水葡萄糖(購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào):MUST-12122601，純度≥98%);苯酚(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20091008)、濃硫酸(成都科龍化工試劑廠，批號(hào):2014031901);無(wú)水乙醇(天津富宇精細(xì)化學(xué)試劑廠，批號(hào):20131116)、乙醚、丙酮、甲醇(天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，分析純);乙腈(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純);磷酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，優(yōu)級(jí)純);水(娃哈哈純凈水)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 微量元素含量測(cè)定

2.1.1 樣品處理

將70 份不同產(chǎn)地的紅芪樣品分別用自來(lái)水沖洗干凈泥土，后用蒸餾水清洗后于60 ℃的恒溫干燥箱烘至恒重，用研缽研細(xì)。每份樣品平行二次，精密稱取1.0000 g 粉末于100 mL 燒杯中，準(zhǔn)確加入濃硝酸與高氯酸(4∶1，v/v)液20 mL，放置24 h 后于電熱板上加熱消化處理，使其保持微沸狀態(tài)，至溶液呈無(wú)色透明狀，停止加熱，冷卻后用1%的硝酸定容于50 mL 容量瓶中，備用?？瞻兹芤和瑯硬僮?。

2.1.2 元素測(cè)定條件

鈣、鉀、鋅、錳、鈷、鋰、鉻、鎂、銅、鐵、鈉、鎳元素含量測(cè)定方法均采用空氣-乙炔火焰原子吸收光譜法，各元素測(cè)定條件見(jiàn)表2。

表2 元素測(cè)定條件Table 2 Determination conditions of trace elements

2.1.3 樣品測(cè)定

將制備的紅芪樣品液按2.1.2 項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄各元素的吸光度值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。其中鈣、鈉、鉀、鎂元素按質(zhì)量濃度范圍分別稀釋不同倍數(shù)。

2.2 活性成分含量測(cè)定

紅芪中毛蕊異黃酮、芒柄花素含量測(cè)定方法依據(jù)文獻(xiàn)［17，18］，紅芪多糖含量測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［19］。

2.3 數(shù)據(jù)處理

以70 份紅芪樣品中12 種微量元素的含量及3種活性成分含量為數(shù)據(jù)，組建數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PERSON 相關(guān)性分析和逐步回歸分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取鈣、鉀、鋅、錳、鈷、鋰、鉻、鎂、銅、鐵、鈉、鎳的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.5 mL 用去離子水定容至50 mL容量瓶中，后分別按表3 所示濃度逐級(jí)稀釋，按2.2項(xiàng)下條件由低到高進(jìn)樣，記錄各金屬元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。在配制鎂元素的溶液時(shí)，加入5 mL 氯化鍶(50 mg/mL)溶液，以消除其它元素的干擾。

表3 各元素標(biāo)準(zhǔn)液濃度回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equation of standard solution concentration and correlation coefficient

3.1.2 精密度試驗(yàn)

分別配制3、4、1.5、2、2、3、2、0.9、5、2、2、5 μg/mL 的鈣、鉀、鋅、錳、鈷、鋰、鉻、鎂、銅、鐵、鈉、鎳的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1.2 項(xiàng)下條件測(cè)定其吸光度值，重復(fù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果各元素吸光度RSD 值分別為1.2%、1.5%、1.2%、0.8%、1.4%、1.1%、0.9%、1.6%、0.4%、1.8%、1.3%、0.7%、0.5%，表明此實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取武都安化鎮(zhèn)米倉(cāng)山李家廟村紅芪栽培樣品，平行6 份，按2.1.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定樣品中鈣、鉀、鋅、錳、鎘、鈷、鋰、鉻、鎂、銅、鐵、鈉元素的含量，結(jié)果各元素吸光度RSD 值分別為1.2%、0.6%、1.1%、0.9%、1.5%、1.9%、1.3%、2.4%、1.3%、1.7%、2.6%、1.2%，表明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取武都安化鎮(zhèn)米倉(cāng)山李家廟村紅芪栽培樣品，按2.1.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在室溫避光條件下，分別于0、8、16、24 h 時(shí)進(jìn)樣，鈣、鉀、鋅、錳、鎘、鈷、鋰、鉻、鎂、銅、鐵、鈉元素吸光度的RSD 值分別為1.9%、2.4%、1.1%、1.8%、1.5%、1.9%、0.5%、1.4%、2.2%、2.5%、1.6%、2.3%，表明供試品溶液在室溫避光條件下24 h 穩(wěn)定，符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.1.5 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取武都安化鎮(zhèn)米倉(cāng)山李家廟村紅芪栽培樣品，平行6 份，分別加入一定濃度的12 種微量元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1.2 條件測(cè)定各元素含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 4 Results of average recovery test (n=6)

3.2 含量測(cè)定

不同產(chǎn)地紅芪樣品中12 種微量元素含量見(jiàn)表5，由表5 可以看出紅芪中Mg、Na、K、Zn、Ca、Fe 元素含量相對(duì)于其他元素較為豐富，不同產(chǎn)地紅芪中各元素含量高低不同，野生紅芪、栽培紅芪、商品紅芪微量元素含量也存在差異性，各元素含量平均含量高低順序?yàn)镸g ＞Na ＞K ＞Zn ＞Ca ＞Fe ＞Mn ＞Li ＞Cu ＞Co ＞Ni ＞Cr;不同產(chǎn)地紅芪樣品中三種活性成分含量見(jiàn)表6，分析表6 可得，70 份不同產(chǎn)地、野生、栽培、商品紅芪中毛蕊異黃酮、芒柄花素、多糖的含量各不相同，其中毛蕊異黃酮的平均含量為21.9732 μg/g，芒柄花素平均值為214.0117 μg/g，紅芪多糖平均值為12.0412%。

3.3 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮與Fe、Mg 元素含量之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.463、0.477;芒柄花素與Fe、Ca、Ni、Mg 元素含量之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.314、0.330、0.323、0.331，與K 元素含量之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.303，而與Cr、Li、Co 元素含量之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.251、-0.292、-0.301;多糖與Zn元素含量之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.239，與Mg 元素含量之間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.445。同時(shí)相關(guān)性結(jié)果還顯示，紅芪中活性成分含量之間也存在相關(guān)性，具體表現(xiàn)為毛蕊異黃酮與芒柄花素含量之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.769，毛蕊異黃酮與多糖含量之間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.358，而芒柄花素與多糖之間存在不顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，系數(shù)為-0.193。

3.4 回歸分析

逐步回歸分析結(jié)果:毛蕊異黃酮(Y1)、芒柄花素(Y2)、多糖(Y3)與Mg(X1)，F(xiàn)e(X2)，Zn(X3)元素具有以下線性關(guān)系。

從三個(gè)方程可以看出，三個(gè)方程均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中Mg 元素對(duì)毛蕊異黃酮的決定系數(shù)為1.909，F(xiàn)e 元素對(duì)毛蕊異黃酮的決定系數(shù)為9.115;其中Mg 元素對(duì)芒柄花素的決定系數(shù)為12.725，F(xiàn)e元素對(duì)芒柄花素的決定系數(shù)為58.328;其中Mg 元素對(duì)多糖的決定系數(shù)為-0.543，Zn 元素對(duì)多糖的決定系數(shù)為-1.312;此結(jié)果與相關(guān)性分析的結(jié)果基本一致。

表5 不同產(chǎn)地紅芪微量元素含量(μg/g)Table 5 The elemental concentrations of Hedysari Radix from different places (μg/g)

表6 不同產(chǎn)地紅芪活性成分含量Table 6 The contents of active ingredients in Hedysari Radix from different places

表7 相關(guān)性分析結(jié)果Table 7 The results of correlation analysis

注:＊＊表示P ＜0.01，* 表示P ＜0.05;MR 代表毛蕊異黃酮，MB 代表芒柄花素，DT 代表多糖。Note:＊＊indicated P ＜0.01，* indicated P ＜0.05;MR:Calycosin;MB:Formononetin;DT:Polysaccharide.

4 結(jié)論與討論

本文測(cè)定了紅芪中微量元素與活性成分含量，發(fā)現(xiàn)野生紅芪與栽培紅芪在活性成分與微量元素含量上均有不同程度的差別。微量元素與活性成分的相關(guān)性及回歸分析結(jié)果表明，紅芪中微量元素含量與活性成分含量之間存在密切的相關(guān)關(guān)系。毛蕊異黃酮與Fe、Mg 元素含量之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明Fe、Mg 含量的升高可能促進(jìn)毛蕊異黃酮的累積或合成，F(xiàn)e 元素為主導(dǎo)元素;芒柄花素與Fe、Ca、Ni、Mg 元素含量之間極顯著正相關(guān)關(guān)系，與K元素含量之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，而與Cr、Li、Co元素含量之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明Fe、Ca、Ni、Mg、K 元素含量的升高可能促進(jìn)芒柄花素的累積或合成，而Cr、Li、Co 元素含量升高可能抑制芒柄花素的累積與合成，其中Fe 元素為主導(dǎo)元素;多糖與Zn 元素含量之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Mg 元素含量之間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明Zn、Mg 元素含量的升高可能抑制多糖的累積與合成。

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