量子點(diǎn)的單分子生物成像

楊丹丹，羅　雪，王潤(rùn)芳，任小苗，馬　迪，張紫薇(綜述)，王　艷(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科一病房，哈爾濱150001)

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量子點(diǎn)的單分子生物成像

楊丹丹△，羅雪△，王潤(rùn)芳△，任小苗△，馬迪△，張紫薇△(綜述)，王艷※(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科一病房，哈爾濱150001)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.038

量子點(diǎn)是直徑在納米范圍(直徑通常為2～10 nm)內(nèi)的熒光半導(dǎo)體，其最新研究使量子點(diǎn)或量子點(diǎn)納米晶體在生物分子及細(xì)胞成像上的應(yīng)用成為可能。盡管量子點(diǎn)具有高度疏水性、毒性及與生物分子不相容性，但其獨(dú)特的性能價(jià)值超過目前已知的有機(jī)染料和熒光蛋白：寬的激發(fā)光譜、可調(diào)和窄的發(fā)射譜及抗漂白能力。生物分子和細(xì)胞成像的第一個(gè)步驟就是功能化兩親配體的疏水表面。雖然功能化的兩親配體的大小大于原來的非涂布狀態(tài)(2.0～9.5 nm)，但這些涂層的量子點(diǎn)基本上對(duì)細(xì)胞是無毒的，且其治療上的應(yīng)用已有報(bào)道[1]。該文簡(jiǎn)要回顧量子點(diǎn)作為熒光探針標(biāo)記細(xì)胞、量子點(diǎn)的DNA診斷及單個(gè)生物分子探測(cè)的生物學(xué)應(yīng)用，并討論其實(shí)現(xiàn)單分子分析的前景。

1量子點(diǎn)的屬性

量子點(diǎn)是直徑為幾納米的單晶體材料，一般由不同類型的半導(dǎo)體材料合成，如硒化鎘、磷化銦、碲化鎘及砷化銦等。不同成分、不同尺寸的量子點(diǎn)提供不同的體積帶隙能量并發(fā)射出特定波長(zhǎng)的光，有代表性的是直徑為2.0～9.5 nm的量子點(diǎn)發(fā)射400～1350 nm波長(zhǎng)的光[2-3]。目前已允許通過控制合成條件來精確控制量子點(diǎn)的大小，這些合成的量子點(diǎn)的核心和核心-殼由于其疏水表面，因此只溶于非極性有機(jī)溶劑。

應(yīng)用量子點(diǎn)作為生物成像的新型熒光探針，其生物相容性是最重要的挑戰(zhàn)。在過去的幾年中，應(yīng)用了各種策略使量子點(diǎn)溶解在水溶液的緩沖區(qū)。硫醇(-SH)包含的分子常用來固定量子點(diǎn)表面的功能基團(tuán)群[4-5]，親水末端，如羧基(-COOH)使量子點(diǎn)變?yōu)樗苄訹6]，低聚的膦[7]、樹狀分子[8]以及肽分子[9]等可以選擇性改變量子點(diǎn)表面性質(zhì)。與這些共價(jià)修飾方法相反，可采用兩親性聚合物涂層或包裹，如二嵌段[10]或三嵌段共聚物[11]、磷脂膠束[12]和多糖[13]。量子點(diǎn)在水中的溶解性和穩(wěn)定性達(dá)到滿意后，下一需求則將面向生物分子探針和活細(xì)胞，包含某種識(shí)別分子功能化量子點(diǎn)表面(如DNA寡核苷酸、RNA、肽、抗體等)。

許多方法可使生物分子與量子點(diǎn)共軛，如非特異性吸附量子點(diǎn)表面的簡(jiǎn)單水溶性小分子物(寡核苷酸[14-15]以及各種血清白蛋白[16]等)。這些非特異性吸附可以很容易地產(chǎn)生生物分子共軛物，但其表面狀態(tài)也易被環(huán)境影響，如離子強(qiáng)度、pH值以及溫度等。帶負(fù)電荷的量子點(diǎn)可與帶正電域的蛋白融合共軛[6]，這為胺基修飾的量子點(diǎn)與羧基修飾的生物分子特異性及穩(wěn)定性吸附提供可能[2,4,8,17-20]，其中最常用的修飾是鏈霉親和素涂層的量子點(diǎn)結(jié)合生物素化的寡核苷酸[12,14-15,20]、蛋白質(zhì)[21]以及抗體[4,10,22-24]等。這些功能流程可重復(fù)，使量子點(diǎn)成為多能熒光探針。雖然通過功能層的形成可使量子點(diǎn)尺寸變大，但沒有證據(jù)表明，共軛的生物分子的生物學(xué)功能被量子點(diǎn)干擾。因此，量子點(diǎn)也能作為有機(jī)染料。

2量子點(diǎn)作為探針在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

量子點(diǎn)在細(xì)胞生物學(xué)中最為成功的應(yīng)用是用作免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞和組織。研究人員基于量子點(diǎn)作為熒光探針已經(jīng)進(jìn)行了各種研究，如膜蛋白質(zhì)[10,25-28]、微管[10]、肌動(dòng)蛋白[2,10]及核抗原的膜染色[10]。由于量子點(diǎn)的信號(hào)本質(zhì)上比有機(jī)染料強(qiáng)，而且能表現(xiàn)出較長(zhǎng)時(shí)間的光穩(wěn)定性和耐光漂白性，使量子點(diǎn)成為理想的探針。量子點(diǎn)所具有的一些光物理性質(zhì)也使其具有局限性，其中之一是量子點(diǎn)在發(fā)光狀態(tài)與非發(fā)光狀態(tài)間的轉(zhuǎn)變所引起的閃爍。量子點(diǎn)這種不連續(xù)的熒光限制了其應(yīng)用，特別是在單分子范圍內(nèi)的應(yīng)用。然而，在某些情況下，這種不連續(xù)發(fā)射有助于從人工免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中區(qū)分量子點(diǎn)信號(hào)。最近，Hohng和Ha[29]的研究表明，量子點(diǎn)閃爍可以被含巰基鈍化表面的量子點(diǎn)抑制。這種防閃爍研究能夠長(zhǎng)期軌跡跟蹤單一的量子點(diǎn)連接，并擴(kuò)大其能力，便于研究膜蛋白或基因轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等。Hoang等[3]的研究表明，抗生物素蛋白受體在HeLa細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜上的表達(dá)可以被生物素化的肽涂層量子點(diǎn)標(biāo)記，并可在單一分子水平觀察到這種結(jié)合物。這種方法可以揭示細(xì)胞膜上糖基錨受體與脂筏之間的關(guān)系。量子點(diǎn)也可用于藥物和基因傳遞系統(tǒng)的單量子點(diǎn)信號(hào)偶聯(lián)。在大多數(shù)情況下，官能化量子點(diǎn)帶有合適的天線(如有針對(duì)性的肽序列)，可使其聚合在內(nèi)涵體。Szymanski等[30]研究表明，顯微注射允許發(fā)送包含功能肽序列的量子點(diǎn)到線粒體和細(xì)胞核。

3量子點(diǎn)的毒性

隨著碳納米材料，如碳納米管和富勒烯的急劇膨脹，量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性已被提出，特別是在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中。由于材料、合成方法、增溶作用以及量子點(diǎn)的官能化協(xié)同使量子點(diǎn)毒性問題變得非常復(fù)雜。大部分報(bào)道發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)應(yīng)用親水殼涂層時(shí)，硒化鎘量子點(diǎn)對(duì)細(xì)胞活力、形態(tài)及功能沒有急性和明顯的毒性[22,31]；但是當(dāng)量子點(diǎn)表面涂層缺乏或Cd2+被釋放時(shí)，細(xì)胞毒性可能發(fā)生，如硒化鎘暴露于空氣可被氧化或損壞[31]。因此，在量子點(diǎn)表面涂層、防止氧化損傷是活細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。因此，需要進(jìn)一步研究以闡明量子點(diǎn)共軛物的安全性，以便安全地進(jìn)行量子點(diǎn)在下一個(gè)階段的應(yīng)用。

4量子點(diǎn)DNA探針的基因組分析

熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的以核酸為基礎(chǔ)的技術(shù)，其能夠在細(xì)胞內(nèi)可視化和映射遺傳物質(zhì)。該技術(shù)一般提供基因或部分基因的具體定位，以及腫瘤細(xì)胞中異?；驍U(kuò)增的基因拷貝數(shù)的定量信息。常用的有機(jī)染料在熒光圖像量化之前迅速被光漂白，而且當(dāng)目標(biāo)數(shù)目有限時(shí)檢測(cè)更困難，更為嚴(yán)重的問題是細(xì)胞固有的自體熒光降低了信號(hào)噪聲比。量子點(diǎn)具有足夠的耐光性、寬的激發(fā)波譜以及窄的發(fā)射波長(zhǎng)范圍，因而是一種非常具有應(yīng)用前景的有機(jī)染料。Xiao等[32-33]采用鏈霉素連接硒化鎘量子點(diǎn)，通過熒光原位雜交技術(shù)分析人類染色體和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系。此外，Luo等[5]采用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)人類精子細(xì)胞中的Y染色體進(jìn)行了檢測(cè)。量子點(diǎn)不僅可以對(duì)人類染色體進(jìn)行檢測(cè)，也可以對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行檢測(cè)，量子點(diǎn)探針可與pUC18質(zhì)粒的多個(gè)克隆位點(diǎn)進(jìn)行序列互補(bǔ)[34]。量子點(diǎn)為基因組分析技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷提供了可能。

5量子點(diǎn)的單分子探針

分析科學(xué)的終極目標(biāo)之一是單分子分析，試圖只從單個(gè)分子中讀出各種分子的信息。量子點(diǎn)因其獨(dú)特的光物理性質(zhì)，即光譜范圍、亮度、長(zhǎng)壽命等是實(shí)現(xiàn)單分子分析的潛力探針。這些特性使量子點(diǎn)單分子探針能長(zhǎng)期跟蹤，適用于在體內(nèi)研究蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)配體轉(zhuǎn)運(yùn)。量子點(diǎn)相對(duì)較大的尺寸、高電子密度等屬性可作為分子來標(biāo)記與它們結(jié)合的生物分子，并使其熒光。有研究人員在實(shí)驗(yàn)中利用原子力顯微鏡和電子顯微鏡，應(yīng)用單量子點(diǎn)跟蹤研究甘氨酸受體的快速橫向動(dòng)力學(xué)[35-36]。明亮的量子點(diǎn)能夠觀察到突觸外和突觸域的多個(gè)交換，其中包括甘氨酸受體在自由基與密閉擴(kuò)散狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變。為了量化觀察結(jié)果，研究人員確定了單量子點(diǎn)跟蹤導(dǎo)致的瞬時(shí)擴(kuò)散系數(shù)。此外，通過電子顯微成像可觀察和明確甘氨酸受體擴(kuò)散進(jìn)入到突觸。利用表面功能多樣性和發(fā)射光譜窄，構(gòu)建了多種顏色量子點(diǎn)修飾的DNA，并應(yīng)用于現(xiàn)有的DNA診斷技術(shù)中，如SNP分型[37]、點(diǎn)突變的檢測(cè)、單個(gè)DNA水平的DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究[38-40]。盡管已經(jīng)揭示了人類基因組序列，但是更重要的是要觀測(cè)何時(shí)、何種蛋白結(jié)合到DNA的何種部位并調(diào)制表達(dá)，這可采用熒光研究評(píng)估或結(jié)合熒光及靜態(tài)成像技術(shù)評(píng)估，如原子力顯微鏡或電子顯微鏡，其不同于傳統(tǒng)的有機(jī)染料，當(dāng)量子點(diǎn)在DNA末端標(biāo)記時(shí)，可進(jìn)行DNA-蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)研究。基于它們的相對(duì)高密度和大的表面積，預(yù)計(jì)會(huì)有更多重要的應(yīng)用。

6結(jié)語

前文討論了量子點(diǎn)的性質(zhì)以及作為新型熒光探針在生物學(xué)的應(yīng)用。目前，在細(xì)胞生物學(xué)中已經(jīng)建立了一些量子點(diǎn)染色方法，但是量子點(diǎn)作為單分子探針的單分子分析仍然具有挑戰(zhàn)性。雖然量子點(diǎn)的獨(dú)特的光物理和形態(tài)特性為生物學(xué)研究提供了一個(gè)方法，但不會(huì)取代傳統(tǒng)有機(jī)染料或熒光蛋白。

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摘要：半導(dǎo)體量子點(diǎn)(量子點(diǎn))是納米尺度的晶體，其具有獨(dú)特的光物理性質(zhì)，如熒光壽命較長(zhǎng)、對(duì)光漂白有獨(dú)特的穩(wěn)定性、較大的帶隙位移及狹窄對(duì)稱的熒光譜峰，這些特性使量子點(diǎn)成為有前途的生物光學(xué)標(biāo)記，如作為免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞和組織、DNA探針及單分子探針等。量子點(diǎn)可用于標(biāo)記DNA序列或電化學(xué)檢測(cè)蛋白質(zhì)。該文就量子點(diǎn)的屬性與毒性及其光學(xué)與電化學(xué)生物的分析應(yīng)用，尤其是量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用予以綜述。

關(guān)鍵詞：量子點(diǎn)；熒光探針；毒性

Study on Single Bio-Molecule Imaging of Quantum DotsYANGDan-dan,LUOXue,WANGRun-fang,RENXiao-miao,MADi,ZHANGZi-wei,WANGYan.(FirstGynecologicalWard,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:Semiconductor quantum dots are nanometre-scale crystals,which have unique photophysical properties,such as longer fluorescence lifetime,unique stability on photobleaching,and larger bandgap displacement and narrow symmetrical fluorescence spectra peak.Such properties enable quantum dots to be the promising optical labels for the biological applications,such as immunofluorescence labeling of cells and tissues,DNA probe and single-molecule probes.Meanwhile,quantum dots can also be used as labels for the electrochemical detection of DNA or proteins.Here is to make a review of the properties and toxicity of quantum dots and their analytical applications in optics and electrochemical biology,especially the application of quantum dots in the area of biomedicine.

Key words:Quantum dots; Fluorescent probe; Toxicity

收稿日期：2014-01-10修回日期：2014-07-21編輯：辛欣

中圖分類號(hào)：R114

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)05-0871-03