Nrf2/ARE通路調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展

易小芳，譚超

Nrf2/ARE通路調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展

易小芳，譚超△

核因子E2相關(guān)因子Nrf2是一個參與多種蛋白表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)中樞，它與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合后可啟動下游多個抗氧化、抗炎蛋白及解毒酶等的表達(dá)，其介導(dǎo)的這一信號通路參與了炎癥、腫瘤等多種病理過程的發(fā)生發(fā)展。本綜述在闡述其基本結(jié)構(gòu)、生物學(xué)效應(yīng)以及介導(dǎo)的信號通路的基礎(chǔ)上，針對各種參與該信號通路正負(fù)向調(diào)控的因素及調(diào)控機(jī)制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，為抗炎癥、抗氧化以及抗腫瘤等生物化學(xué)治療提供了新的靶點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上，本文也展望了生物信息學(xué)技術(shù)的應(yīng)用將會為這一靶點(diǎn)的干預(yù)提供更好的發(fā)展前景。

Nrf2；Nrf2/ARE信號通路；氧化性應(yīng)激

核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-derived factor 2-related factor，Nrf2）屬于Cap′-n′-Collar（CNC）家族的轉(zhuǎn)錄因子［1］。作為抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）結(jié)合，啟動下游多個抗氧化、抗炎蛋白及解毒酶等的表達(dá)，構(gòu)成Nrf2/ARE通路，是機(jī)體抵御各種氧化應(yīng)激的重要保護(hù)通路。Nrf2在解毒器官如肝、腎以及與外界環(huán)境接觸的器官，如皮膚、肺、消化道等有大量表達(dá)。作為抗氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)中樞，Nrf2在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)及其調(diào)控具有重要意義，本文對新近研究進(jìn)行綜述。

1 Nrf2的基本結(jié)構(gòu)

Nrf2含589個氨基酸，屬于CNC家族的堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子［2］，含有6個區(qū)，即Neh1～6，其中Nehl區(qū)的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)bZIP可與小Maf蛋白結(jié)合形成異源二聚體，進(jìn)而獲得與抗氧化元件ARE上DNA分子結(jié)合的能力，Neh2是Nrf2與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結(jié)合的區(qū)域，這一區(qū)域即Nrf2的第69～84氨基酸這一包含16個氨基酸的短肽，它包含了與Keap1結(jié)合的ETGE基序和DLG結(jié)合位點(diǎn)。Neh4和Neh5區(qū)則是和共激活因子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）結(jié)合后輔助Nrf2靶基因轉(zhuǎn)錄激活［3］，這一過程與Nrf2的第596和599位氨基酸被CREB（CREBBP）乙酰化有關(guān)。Neh6區(qū)含有大量的絲氨酸殘基，是氧化還原非敏感區(qū)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下與Nrf2的降解相關(guān)。另外，Nrf2的第40位氨基酸是磷酸化位點(diǎn)，Nrf2的磷酸化對其與Keap1解離及發(fā)揮生物學(xué)功能有關(guān)。

2 Nrf2的活性

2.1 Nrf2/Keap1復(fù)合體 在生理狀態(tài)下，Keap1作為Nrf2的負(fù)調(diào)控因子將Nrf2鎖定在胞漿內(nèi)并介導(dǎo)其泛素化以維持胞內(nèi)Nrf2的穩(wěn)態(tài)［4］。Keap1由BTB、IVR、雙甘氨酸重復(fù)區(qū)域（double glycine repeat or Kelch repeats，DGR）以及CTR4個部分組成［5］。其中，Keap1的DGR區(qū)可分別與Nrf2Neh2區(qū)的DLG基序和ETGE基序結(jié)合，即1分子Nrf2可以結(jié)合2分子Keap1，同時DGR區(qū)也是Keap1與胞漿內(nèi)肌動蛋白結(jié)合的部位。Keap1的DGR區(qū)由6個重復(fù)的雙甘氨酸序列形成一個“口袋”樣結(jié)構(gòu)與Nrf2Neh2區(qū)的DLG或ETGE基序結(jié)合，在Nrf2與Keap1結(jié)合時，1分子Keap1的DGR區(qū)與Nrf2 的DLG結(jié)合，另1分子Keap1的DGR區(qū)與Nrf2的ETGE基序結(jié)合，而這2分子Keap1會形成一個二聚體，Keap1的BTB區(qū)則參與Keap1二聚體的形成，并調(diào)節(jié)Nrf2與Keap1的結(jié)合［6］。當(dāng)氧化應(yīng)激時，由各種因素導(dǎo)致Keap1及其二聚體空間構(gòu)象發(fā)生改變時，Nrf2即可與Keap1解離，繼而入核發(fā)揮生物學(xué)功能。

2.2 Nrf2/ARE通路 ARE是位于一些保護(hù)性基因上游調(diào)節(jié)區(qū)的一個DNA-啟動子結(jié)合序列，而Nrf2是這一序列的激活因子，當(dāng)活化的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核與Maf蛋白（包括MafG、MafK、MafF）結(jié)合成異二聚體后與ARE序列結(jié)合，使受ARE調(diào)控的基因開始轉(zhuǎn)錄，從而啟動Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶等保護(hù)性基因的表達(dá)［7-8］。ARE與Nrf2的這種結(jié)合不僅需要其與Maf蛋白結(jié)合形成二聚體，更重要的是Nrf2對氧化還原敏感，因此它們之間的這種結(jié)合較具專一性，這使得該通路成為機(jī)體抗氧化等防御機(jī)制中的重要通路。

2.3 生物學(xué)功能 Nrf2是目前發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激時最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，它參與細(xì)胞氧化應(yīng)激等多種防御機(jī)制，從而在炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。它啟動抗氧化基因的表達(dá)以及誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶的產(chǎn)生在機(jī)體對抗氧化、親電子以及外源性毒物損傷過程中起到?jīng)Q定性作用［9］。Nrf2 與ARE結(jié)合繼而啟動了下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，在這個過程中，ARE被Nrf2結(jié)合并激活是較具專一性的，這使得Nrf2在機(jī)體防御尤其是抗氧化過程中至關(guān)重要，因而最終作為抗氧化、解毒、抗炎、抗腫瘤等防御機(jī)制中的重要靶點(diǎn)。

3 Nrf2/ARE通路的調(diào)節(jié)

3.1 Nrf2/ARE通路的激活

3.1.1 Nrf2/ARE通路的正常生理激活 正常狀況下，鎖定1個分子Nrf2的Keap1二聚體與E3泛素連接酶形成復(fù)合物，介導(dǎo)Nrf2的泛素化降解［10］。當(dāng)應(yīng)激時，Nrf2的磷酸化、Keap1中對氧化還原敏感的半胱氨酸殘基特別是Cys257、Cys273、Cys288、Cys293被修飾以及Keap1構(gòu)象發(fā)生改變，使得Nrf2的低親和力位點(diǎn)DLG與Keap1發(fā)生解離，而另一個結(jié)合基序ETGE由于親和力高仍與Keap1結(jié)合，這一變化恰巧阻止了Nrf2的降解，當(dāng)Keap1被飽和后，新合成的Nrf2進(jìn)入核內(nèi)與ARE結(jié)合，啟動目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，即Nrf2/ARE通路被激活。這就是鉸鏈和鎖存模型［11］。而激活Nrf2/ARE通路的途徑除了使Keap1構(gòu)象改變，釋放Nrf2入核外，還通過Keap1的降解來增強(qiáng)這一信號通路。某些miRNA如miRNA200a可以作用于Keap1 mRNA的3′-UTR使得Keap1的mRNA降解［12］，也有報道稱氧化及電離輻射應(yīng)激時，Cul3依賴的泛素化會由Nrf2轉(zhuǎn)移至Keap1，使得Keap1自身發(fā)生降解，Nrf2得以釋放，啟動Nef2/ARE通路［13］。Nrf2與Keap1結(jié)合主要依靠其高親和力結(jié)合基序ETGE，而含有ETGE基序的這一類物質(zhì)如PALB2則通過阻斷Keap1與Nrf2的結(jié)合對Nrf2/ARE通路進(jìn)行正向調(diào)節(jié)。最近也有報道稱某些抑癌蛋白也可通過與Keap1結(jié)合來激活Nrf2/ARE通路［14］。

3.1.2 Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的Nrf2/ARE通路激活 5，6-二氫環(huán)戊烯-1，2-二硫雜環(huán)戊烯-3-硫酮（5，6-dihydrocyclopenta-1，2-dithiole-3-thione，CPDT）及蘿卜硫素（sulforaphane，SF）等Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑可以快速升高Nrf2的濃度，進(jìn)而增強(qiáng)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，但它們并不調(diào)節(jié)Nrf2基因的轉(zhuǎn)錄以及Keap1的表達(dá)。同時，它們也不引起Nrf2-Keap1及泛素化酶復(fù)合體的解離；相反，它們都能抑制Nrf2的磷酸化以維持Nrf2與Keap1的結(jié)合。研究表明，它們主要是通過進(jìn)入細(xì)胞核，在核內(nèi)抑制Nrf2蛋白酶體降解以維持其蛋白穩(wěn)定性這種方式來增強(qiáng)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性［15］。但CPDT與SF在Keap1敲除的細(xì)胞中又沒有升高Nrf2的能力，由此推斷它們是通過Keap1依賴和非依賴兩種方式調(diào)節(jié)Nrf2的活性［16］。

3.1.3 其他與Nrf2/ARE通路激活有關(guān)的因素 研究發(fā)現(xiàn)Nrf2的基礎(chǔ)骨架和亮氨酸拉鏈區(qū)域分別含有1個核定位信號和1個核輸出信號，Neh5區(qū)域上含有1個氧化敏感的核輸出信號，這些發(fā)現(xiàn)表明Nrf2可能自發(fā)地響應(yīng)外界信號，非Keap1依賴地入核執(zhí)行轉(zhuǎn)錄功能［17］。

3.2 Nrf2/ARE通路的負(fù)向調(diào)節(jié)

3.2.1 Keap1介導(dǎo)的Nrf2/ARE通路負(fù)向調(diào)節(jié) 在Nrf2/ARE通路的負(fù)向調(diào)節(jié)中最主要的就是Keap1這一因素，它不僅將Nrf2鎖定在胞漿內(nèi)，還通過泛素化對Nrf2進(jìn)行快速降解，對于細(xì)胞內(nèi)Nrf2水平的穩(wěn)態(tài)起巨大作用。此外，Keap1也可以在應(yīng)激誘導(dǎo)后通過阻斷Nrf2與ARE的結(jié)合來抑制Nrf2/ ARE通路的激活。Keap1對Nrf2的抑制作用在Nrf2/ARE通路的負(fù)向調(diào)節(jié)中占主導(dǎo)地位。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA參與Nrf2/ARE的負(fù)向調(diào)節(jié)。譬如，miR-144在MLL （myelogenous leukaemia）細(xì)胞株中可以抑制Nrf2 mRNA的表達(dá)［18］，miR-28a在乳腺上皮細(xì)胞中可以靶向作用于Nrf2mRNA的3′-UTR，引起Nrf2 mRNA的降解，從而負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2/ARE通路［19］，這些都是直接作用于Nrf2從而達(dá)到負(fù)向調(diào)節(jié)作用的。

3.2.2 核因子（NF）-κB介導(dǎo)的 Nrf2/ARE通路負(fù)向調(diào)節(jié) NF-κB和Nrf2均在機(jī)體的免疫和抗氧化調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)NF-κB信號通路激活時，Nrf2信號通路會受到抑制。已有研究表明，NF-κB的p56亞基強(qiáng)烈抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，并且p56的C-端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)對于p56的反抑制功能是必不可少的，但與其激活靶基因的能力無關(guān)，P56抑制Nrf2與Keap1不同，它主要是從兩個層面來影響Nrf2的活性，一是抑制Nrf2與MafK的二聚化來直接導(dǎo)致DNA的結(jié)合能力減弱；另一方面是抑制Nrf2-CREB的相互作用，CREB協(xié)同參與Nrf2對目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)，p56通過與Nrf2競爭結(jié)合CREB從而間接的抑制了Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性［20］。這一研究發(fā)現(xiàn)為針對NF-κB介導(dǎo)的促炎、促腫瘤提供了新的治療途徑。

3.2.3 轉(zhuǎn)錄抑制因子介導(dǎo)的Nrf2/ARE通路負(fù)向調(diào)節(jié) Nrf2需要與Maf蛋白形成異二聚體后才可與ARE結(jié)合，而現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)廣泛存在的轉(zhuǎn)錄抑制因子Bach1在某種程度上存在與Nrf2競爭性結(jié)合Maf蛋白的現(xiàn)象，從而可以在Nrf2 與ARE結(jié)合這一環(huán)節(jié)阻遏這一抗氧化通路的啟動，參與Nrf2/ARE通路的負(fù)向調(diào)節(jié)［21］。

綜上所述，Nrf2/ARE通路是體內(nèi)重要的抗氧化、抗炎、抗腫瘤通路，但最近也有文獻(xiàn)報道其促使了腫瘤的生長［22］，對其通路的調(diào)節(jié)成為疾病生物化學(xué)治療的一個重要靶點(diǎn)。目前尚未得到Nrf2的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，而其蛋白空間結(jié)構(gòu)可能有助于更好地研究Nrf2及其介導(dǎo)的信號通路，同時也可以采用生物信息學(xué)方法對可能與Nrf2/ARE通路有相互作用的物質(zhì)，如miRNA、化學(xué)藥物等進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬并做出預(yù)測，從而有效地縮短篩選該通路調(diào)控分子的時間。

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（2014-08-11收稿 2014-10-20修回）

（本文編輯 李國琪）

Research progress of Nrf2/ARE pathway regulating mechanism

YI Xiaofang，TAN Chao△
The First Clinical Medical College，Three Gorges University，Yichang 443002，China
△Reviser E-mail：yczxyytanchao@sina.com

Nuclear factor E2 related factor Nrf2 is a nuclear transcription factors involved in a variety of protein expression.As a center of oxidative stress regulation，it combines with antioxidant components（antioxidant responsive element，ARE）and activates downstream multiple anti-oxidation，anti-inflammatory and detoxifying enzyme protein expression.This signaling pathway is involved in the development of inflammation，tumor and other pathological process.This review describes the basic structure，biological effects and signaling pathways of Nrf2，summarizes the latest progress about mechanisms of factors，which are involved in the positive and negative regulations of signal pathway，providing a new target for antiinflammatory，antioxidant，and antitumor biochemical treatment.Based on these，the paper also looks forward to applicating bioinformatics technology and providing better prospects for the development of target intervention.

Nrf2；Nrf2/ARE signal pathway；oxidative stress

R392.1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.032

湖北宜昌，三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科（郵編443002）

易小芳（1976），女，本科，主管技師，從事生殖免疫方面研究

△審校者 E-mail：yczxyytanchao@sina.com