基因診斷技術(shù)及其臨床應(yīng)用

李姍珊(綜述)，焦　娟(審校)

(北京軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科，北京 100700)

基因診斷技術(shù)及其臨床應(yīng)用

李姍珊(綜述)，焦娟※(審校)

(北京軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科，北京 100700)

摘要：基因診斷技術(shù)是傳統(tǒng)診斷技術(shù)的一個有效補充，其可以在基因水平上對疾病進(jìn)行預(yù)測、防治和診斷。其主要通過分子生物學(xué)方法對患者體內(nèi)的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平進(jìn)行檢測，對相應(yīng)的基因進(jìn)行突變分析，以達(dá)到診斷特定疾病的目的。目前基因診斷技術(shù)已在臨床多個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。該文就目前基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)原理和特點進(jìn)行概述，并詳細(xì)介紹基因診斷技術(shù)在遺傳性疾病、感染性疾病、癌癥和血液病中的臨床應(yīng)用情況。

關(guān)鍵詞：基因診斷；聚合酶鏈反應(yīng)；臨床應(yīng)用

基因診斷是指利用分子生物學(xué)方法，從DNA或RNA水平檢測患者體內(nèi)基因存在和表達(dá)狀態(tài)，分析基因結(jié)構(gòu)變異情況，進(jìn)而對疾病作出診斷的方法和過程?；蛟\斷建立在分子生物學(xué)理論和技術(shù)高速發(fā)展的基礎(chǔ)之上，被稱之為繼臨床診斷、生物化學(xué)診斷以及免疫學(xué)診斷之后的第4代診斷技術(shù)。目前認(rèn)為，一切疾病均可以在基因水平找到答案，通過基因診斷技術(shù)對相應(yīng)基因進(jìn)行檢測，可達(dá)到早檢測、早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療的目的，這是因為其相對于傳統(tǒng)診斷技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、診斷范圍廣等優(yōu)點，并且可以進(jìn)行直接和早期診斷?；蛟\斷具有較強的特異性和靈敏性，因此可直接對個體的基因狀態(tài)進(jìn)行檢測，達(dá)到對表型正常的攜帶者或特定疾病的易感者作出診斷和預(yù)測的目的[1-2]。現(xiàn)就基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)及其臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1基因診斷技術(shù)

1.1分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)又被稱為核酸分子雜交技術(shù)，其基本原理是將具有同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下(適當(dāng)?shù)臏囟群碗x子強度等)按堿基互補原則退火形成異質(zhì)雙鏈。根據(jù)檢測樣品不同可分為DNA印跡雜交、RNA印跡雜交、點雜交(Dot雜交)和原位雜交。DNA印跡雜交和RNA印跡雜交具有高度特異性和靈敏性，常用于特定基因的定量和定性檢測、基因突變分析以及疾病診斷等。Dot雜交用于檢測樣品中是否存在特異的DNA或RNA，可得到半定量結(jié)果。Dot雜交具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，是基因診斷常用方法之一。原位雜交可確定探針的互補序列在胞內(nèi)的空間位置，因此具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。此外，原位雜交還可顯示病原微生物存在的方式和部位。目前，基于分子雜交技術(shù)的原理又發(fā)展出多種新技術(shù)，如熒光原位雜交、多色熒光原位雜交和比較基因組雜交等。分子雜交技術(shù)被廣泛應(yīng)用于對遺傳病、癌癥及感染性疾病的診斷[3]。

1.2聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)PCR誕生于1985年，其是一種模擬天然DNA復(fù)制過程的體外擴增法。首先通過高溫(90～96 ℃)將雙鏈DNA變性，即將雙鏈DNA解螺旋為單鏈DNA；再以此單鏈DNA為模板，將溫度降至50～60 ℃，以便引物與模板DNA堿基互補配對結(jié)合；然后在70～75 ℃條件下，在DNA聚合酶的參與下，以dNTP為原料，根據(jù)堿基互補配對原則合成一條新鏈。如此循環(huán)將目的基因迅速擴增。利用PCR技術(shù)可將任意目的基因在體外進(jìn)行特異性擴增。隨著RCR技術(shù)的不斷成熟和發(fā)展，在其基礎(chǔ)上衍生出多種類型的PCR技術(shù)，如熱啟動PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR等。PCR技術(shù)與其他技術(shù)的結(jié)合使其應(yīng)用性得到更廣泛的發(fā)展，目前PCR技術(shù)主要用于基因缺失或點突變所致疾病的檢測[4]以及病原微生物的檢測。

2000年日本學(xué)者研發(fā)出一種新的核苷酸擴增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法，與常規(guī)PCR相比，其操作步驟更為簡單，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點[5]。目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，在臨床檢驗中主要用于病原體感染方面的檢測。

1.3DNA測序技術(shù)DNA測序是進(jìn)行突變分析最重要、最直接的方法，其不受其他篩選方法敏感性和特異性的限制。DNA測序方法主要包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法，前者更為常用。Sanger雙脫氧鏈終止法的原理是利用DNA聚合酶將結(jié)合在待定序列模板上的引物延伸，反應(yīng)池中包含4種堿基，并混入一定量的雙脫氧核苷酸，當(dāng)雙脫氧核苷酸結(jié)合到新合成的DNA上，即可終止DNA鏈的延伸，進(jìn)而產(chǎn)生長度不等的DNA片段，再由高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。由于雙脫氧核苷酸上標(biāo)記有同位素，因而可采取放射自顯影讀取結(jié)果。現(xiàn)在的直接測序法采用四色熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記，避免了放射傷害，測序自動化程度大為提高，操作更加簡便[6]。

1.4基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是將許多特定的基因片段有規(guī)律地排列并固定于支持物上，形成儲存有大量信息的DNA陣列，然后與待測的標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強弱，獲得樣品的分子數(shù)量和序列信息，進(jìn)而對基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高通量、平行化及集約化的處理和研究?；蛐酒夹g(shù)的出現(xiàn)使對遺傳信息進(jìn)行高效、快速的分析成為可能[7]?；蛐酒夹g(shù)具有快速、簡便、高靈敏性和準(zhǔn)確性的特點，最重要的是其還可以同時對多種疾病進(jìn)行檢測，便于臨床醫(yī)師了解患者整體的患病情況。

1.5免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)，其是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，將特異性抗體用顯色劑標(biāo)記，根據(jù)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)和化學(xué)呈色反應(yīng)對組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原進(jìn)行定位、定性和定量檢測的一項技術(shù)。目前常用的免疫組織化學(xué)方法有免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)。由于免疫組織化學(xué)技術(shù)具有快速、簡便、定位準(zhǔn)確和特異性強等優(yōu)點，目前廣泛應(yīng)用于病原體檢測、腫瘤病理學(xué)檢測、腎活檢、自身抗體檢測及傳染病的快速診斷[8]。

2基因診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用

2.1在遺傳性疾病中的應(yīng)用基因診斷是基于分子遺傳學(xué)發(fā)展而來的，因此其在遺傳性疾病的診斷及預(yù)測方面的表現(xiàn)尤為突出，其對已明確致病基因的遺傳病有較好的診斷效果?；蛟\斷可在疾病發(fā)生和發(fā)展的不同層面、不同階段進(jìn)行診斷。首先可進(jìn)行臨床癥狀基因診斷，即醫(yī)師根據(jù)就診患者的病史、臨床癥狀，為明確或排除某一疾病而進(jìn)行的檢查，如珠蛋白生成障礙性貧血的基因診斷[9]、苯丙酮尿的診斷[10]等。臨床基因診斷一般不難，但臨床意義也有限。癥狀前基因診斷主要用于遺傳病家系或有遺傳病傾向的家系中未發(fā)病但有高度發(fā)病風(fēng)險人群的診斷，其對早期診斷后可實施預(yù)防性干預(yù)措施，進(jìn)而避免出現(xiàn)嚴(yán)重不良后果的疾病有重要意義，如對導(dǎo)致藥物性耳聾的相關(guān)基因進(jìn)行檢測，早期預(yù)防，可避免藥物性耳聾的發(fā)生[11-12]。遺傳性疾病最可怕之處在于其可以影響下一代，因而通過基因診斷預(yù)測子代的基因狀態(tài)，在必要時進(jìn)行干預(yù)，避免有重大基因缺陷的胎兒出生。這種針對胎兒進(jìn)行的診斷又分為產(chǎn)前基因診斷和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷。產(chǎn)前基因診斷主要是針對有生育患兒風(fēng)險的夫婦的胎兒進(jìn)行的診斷，采用的標(biāo)本常為絨毛膜標(biāo)本和羊水標(biāo)本。這兩種標(biāo)本的采集方式具有一定的創(chuàng)傷性，對母嬰的傷害很難避免。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，孕婦外周血中的胎兒有核細(xì)胞或游離胎兒DNA含量已滿足檢測要求，因此可采用孕婦外周血進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，有效避免了對母嬰的傷害。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷是在受精卵分裂至6～8個細(xì)胞的卵裂球階段，取其中1～2 個細(xì)胞進(jìn)行基因診斷，挑選正常胚胎植入母體[13-14]。

2.2在感染性疾病中的應(yīng)用感染性疾病是病原微生物侵入機體導(dǎo)致的，因此可針對各病原體的特異和保守序列設(shè)計引物。對病原體的DNA采用PCR技術(shù)直接檢測，針對RNA病毒，則可采用實時熒光定量PCR技術(shù)得以實現(xiàn)。目前已獲得部分病原微生物的全部基因序列，因此，將某種病原微生物的特異保守序列集成排列在一塊芯片上，可高效、快速、準(zhǔn)確地檢測出致病病原體，從而對疾病做出診斷。另外，某些特定基因的存在或基因突變可使機體對某些病毒或細(xì)菌等病原體的易患性增加。因此，一旦確定易患基因的存在，及早對高危人群采取預(yù)防措施或醫(yī)療干預(yù)可有效降低機體的感染率。基因診斷具有簡便、快速、特異及敏感的優(yōu)點，目前已在病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體、立克次體及寄生蟲感染的早期診斷中得到應(yīng)用[2]。目前已知的與疾病感染相關(guān)的病原微生物幾乎都已建立了相應(yīng)的PCR檢測方法[15-16]，其原理是通過設(shè)計特異的引物對病原微生物的目標(biāo)基因進(jìn)行擴增，或?qū)?xì)菌的18S rRNA、真菌的28S rRNA進(jìn)行檢測，以達(dá)到鑒定病原微生物的目的。與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法相比此方法具有耗時短、敏感性和特異性高的優(yōu)點。除此之外，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測，隨著該技術(shù)的完善，目前已成功用于非典型性呼吸綜合征、禽流感、人類免疫缺陷病毒、瘧疾、弓形蟲等疾病病原體和寄生蟲等方面的檢測[17-20]。

基因診斷技術(shù)也可用于感染性疾病病原菌耐藥基因的檢測。病原菌的耐藥問題是臨床面臨的難題之一，如果能及時檢測病原菌的耐藥基因，規(guī)避耐藥藥物，選擇敏感或相對敏感的藥物進(jìn)行治療會達(dá)到事半功倍的效果，如乙型肝炎耐藥基因序列檢測和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測等[21]。

2.3在癌癥疾病中的應(yīng)用癌癥的發(fā)展過程極為復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，其發(fā)生與多種因素有關(guān)，并且在發(fā)展過程中涉及多個基因的變化，因而癌癥屬于多基因病。由于癌癥的發(fā)生和發(fā)展主要基于基因的變化，因此基因診斷在癌癥中有廣闊的應(yīng)用前景。目前已發(fā)現(xiàn)多種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的癌基因和抑癌基因，而且這些基因的突變常發(fā)生在臨床癥狀出現(xiàn)之前。因此通過對相關(guān)基因的檢測可以達(dá)到早預(yù)防和早診斷的目的。另外，基因診斷可對腫瘤進(jìn)行分級、分期及判斷預(yù)后，也可對微小病灶、轉(zhuǎn)移灶及血中殘留癌細(xì)胞進(jìn)行識別檢測，并對治療效果進(jìn)行評價。檢查癌基因的變化不僅有助于腫瘤的診斷和預(yù)后判斷，而且還可輔助判斷手術(shù)中腫瘤切除是否徹底、有無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等[22-24]。

2.4在血液病中的應(yīng)用血液病主要包括白血病和血友病。目前研究結(jié)果顯示，白血病的病因主要是白血病細(xì)胞中存在某些特定的融合基因或基因重排[25]，不同的白血病類型其融合基因不同，因而對融合基因或基因重排進(jìn)行檢測，可對白血病進(jìn)行分型，為白血病的治療提供有效的分子靶標(biāo)。血友病A為X連鎖隱形遺傳性出血性疾病，是凝血因子Ⅷ基因缺陷引起的，通過基因診斷技術(shù)可有效地篩查出基因缺陷的攜帶者，并為產(chǎn)前診斷提供有效的診斷依據(jù)[26]。

3小結(jié)

隨著科技的發(fā)展和研究的日益成熟，越來越多的基因診斷方法開始從單純的實驗研究走向臨床應(yīng)用，但該過程也不可避免地存在一些問題。首先，基因診斷技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化問題。目前尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)程和質(zhì)量認(rèn)證體系，標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，質(zhì)量難保證。其次，基因診斷過程中涉及的倫理學(xué)問題及所用資源及信息的安全性問題[27]。盡管基因診斷還存在諸多問題，但是伴隨著新技術(shù)的日益成熟和發(fā)展，其在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用將更加廣泛。

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Progress in Clinical Application of Gene DiagnosisLIShan-shan,JIAOJuan.(DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingMilitaryCommandGeneralHospitalofPLA,Beijing100700,China)

Abstract:Gene diagnosis technique is an effective supplement to the traditional diagnosis technology,which can predict,prevent and diagnose diseases on gene level.Gene diagnosis technique uses molecular biological methods to detect the structure and expression levels of genetic material,and analyze the corresponding gene mutation,in order to achieve the diagnosis of specific diseases.At present,gene diagnosis technology has been widely used in clinical fields.Here summarizes the present principles and characteristics of molecular biology techniques used in gene diagnosis,and introduces the clinical application of gene diagnosis in genetic diseases,infectious diseases,cancer and blood diseases.

Key words:Gene diagnosis; Polymerase chain reaction; Clinical application

收稿日期：2015-04-21修回日期：2015-07-05編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.047

中圖分類號：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)17-3198-03