泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與線粒體關(guān)系研究進(jìn)展

竇忠霞，張曉梅，孟曉波(綜述)，王　舉(審校)

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 a.兒科，b.普外科，呼和浩特 010017)

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與線粒體關(guān)系研究進(jìn)展

竇忠霞a，張曉梅a，孟曉波a(綜述)，王舉b※(審校)

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 a.兒科，b.普外科，呼和浩特 010017)

摘要：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是真核細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白降解系統(tǒng)，參與多種生物學(xué)活動(dòng)，包括細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及翻譯等。UPS異常與人類許多惡性腫瘤、神經(jīng)退行性病變、心血管疾病及糖尿病等疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。UPS各組分已成為許多疾病的研究焦點(diǎn)。UPS與線粒體關(guān)系密切，不但參與線粒體蛋白質(zhì)量控制、維持線粒體形態(tài)，而且直接介導(dǎo)線粒體自噬。

關(guān)鍵詞：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；線粒體；細(xì)胞周期調(diào)控；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；細(xì)胞凋亡

Apoptosis

人體細(xì)胞中存在多種蛋白降解途徑，研究最多的是溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體(ubiquitin-proteasome system，UPS)途徑，其中溶酶體途徑主要降解細(xì)胞內(nèi)吞的胞外蛋白質(zhì)，UPS主要降解胞內(nèi)泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)。UPS通過一系列酶促級聯(lián)反應(yīng)對細(xì)胞內(nèi)一些半衰期短的調(diào)節(jié)蛋白和一些結(jié)構(gòu)異常、錯(cuò)構(gòu)或受損傷的蛋白進(jìn)行泛素化，最終導(dǎo)致泛素化的蛋白質(zhì)被蛋白酶體降解或發(fā)生功能改變。該途徑的異常與細(xì)胞內(nèi)多種病理狀態(tài)及許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。線粒體是細(xì)胞氧化供能中心，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)量分布及代謝等均易受細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境的影響而發(fā)生明顯的變化。而泛素連接酶的功能異常可直接造成線粒體功能異?！，F(xiàn)就UPS系統(tǒng)與線粒體關(guān)系的研究進(jìn)展予以綜述。

1UPS的組成結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能

UPS由泛素、泛素活化酶、泛素結(jié)合酶、泛素連接酶、26S蛋白酶體及去泛素化酶等組成，單獨(dú)的泛素沒有任何生物學(xué)功能。其發(fā)揮作用首先在腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)供能的情況下被泛素活化酶激活；然后將其轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶上，通過硫酯鍵與泛素結(jié)合酶活性位點(diǎn)的半胱氨酸相連；最后由泛素連接酶募集特異的底物和泛素結(jié)合酶，促使泛素從與泛素結(jié)合酶形成的硫酯中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到靶蛋白賴氨酸殘基上，將底物泛素化[1]。由于泛素分子本身有7個(gè)賴氨酸殘基位點(diǎn)，且泛素本身的賴氨酸殘基也可與泛素分子相互結(jié)合，因此底物蛋白的一個(gè)賴氨酸殘基可能結(jié)合多個(gè)泛素分子，當(dāng)泛素的賴氨酸殘基連接4個(gè)或者超過4個(gè)泛素標(biāo)簽時(shí)，則底物蛋白就可能被26S蛋白酶識別而降解[2]。此外，細(xì)胞內(nèi)還存在多種去泛素化酶，它們能催化水解泛素分子C端的多肽鏈連接，將泛素分子從底物上水解下來，重復(fù)利用。UPS通過泛素化或去泛素化調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的水平，并影響其功能，對維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定具有重要的意義。

2UPS與線粒體

2.1UPS與線粒體蛋白質(zhì)量控制線粒體的氧化磷酸化是一把雙刃劍，在產(chǎn)生ATP的同時(shí)也產(chǎn)生活性氧類(reactive oxygen species，ROS)。ROS可使其周圍的蛋白質(zhì)立即發(fā)生錯(cuò)疊及集聚，且基因突變、應(yīng)激、蛋白質(zhì)的跨膜異位等均可使蛋白結(jié)構(gòu)異常，這些錯(cuò)疊的蛋白必須清除，否則可使線粒體功能異常[3]。UPS在維持線粒體的蛋白質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要的作用，線粒體外膜有多種泛素連接酶，如線粒體泛素連接酶(mitochondrial ubiquitin ligase，MITOL)和SCF(skp1-cullin-F-boxMdm30)復(fù)合體。體外泛素化實(shí)驗(yàn)表明，MITOL可直接與突變型超氧化物歧化酶1(mutant superoxide dismutase 1，mSOD1)結(jié)合，MITOL過度表達(dá)促進(jìn)mSOD1降解和抑制線粒體mSOD1的積累及mSOD1誘導(dǎo)的ROS的生成；相反的，MITOL突變體可導(dǎo)致mSOD1在線粒體中積累，從而提高mSOD1誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞死亡[4]。而SCF、Parkin則與線粒體外膜上蛋白果蠅洋蔥(drosophila melanogaster fuzzy onions，F(xiàn)zo)和mfn2(mfn1和mfn2是哺乳動(dòng)物fzo的同源物，兩者有80%的相似性)降解有關(guān)，其結(jié)構(gòu)異?？蓪?dǎo)致線粒體功能異常[5-6]。最近，有學(xué)者報(bào)道，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)加入蛋白酶體抑制劑，線粒體內(nèi)膜上的解偶蛋白2、3及基質(zhì)內(nèi)寡霉素敏感授予蛋白異常增加[7-8]，表明線粒體內(nèi)的蛋白降解與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的UPS有關(guān)，但機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為其可能與Cdc48有關(guān)，Cdc48是ATPase associated with various cellular activities(AAA)超家族成員之一，其哺乳動(dòng)物的同源蛋白為p97；線粒體應(yīng)激時(shí)VCP/Cdc48-associated mitochondrial stress-responsive-Vms1(Vsm1)由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，通過其C端VIM基序與Cdc48結(jié)合，該復(fù)合物一方面增強(qiáng)26S蛋白酶體的功能[9]，另一方面招募Nf14蛋白至線粒體外膜并與其形成一種類似分子伴侶的Vsm1-Cdc48-Nf14復(fù)合體，該復(fù)合體能夠識別并轉(zhuǎn)運(yùn)泛素化的蛋白到26S蛋白酶體進(jìn)行降解[10]。而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解的過程中，Cdc48/p97是反常折疊蛋白的識別因子和病理效應(yīng)器，陪伴底物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞質(zhì)中，通過泛素蛋白酶體途徑降解[11-12]。因此，有學(xué)者認(rèn)為線粒體內(nèi)蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)降解的機(jī)制可能與此有關(guān)，即Cdc48/p97所介導(dǎo)的蛋白質(zhì)“復(fù)位”[13]。

2.2UPS與線粒體的形態(tài)動(dòng)力學(xué)線粒體的分裂/融合需要多個(gè)蛋白復(fù)合體，它們的功能受多種因素影響。已知參與線粒體分裂/融合的蛋白主要有Fzo和動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)。Fzo基因編碼的蛋白位于線粒體的外膜，其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致線粒體的融合及呼吸功能異常。Cohen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在酵母菌Mdm30基因剔除細(xì)胞，F(xiàn)zo1蛋白表達(dá)比正常細(xì)胞增加，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少，體積增大；重新導(dǎo)入Mdm30基因后，細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)及Fzo1蛋白的表達(dá)恢復(fù)正常。如果Mdm30基因缺乏F-box基序，則Mdm30功能喪失。F-box蛋白是泛素連接酶SCF復(fù)合體的重要組分之一。F-box在與結(jié)合蛋白Skpl、骨架蛋白Cullin/Cdc53p、Ring Finger形成SCF復(fù)合體的同時(shí)招募特殊的泛素結(jié)合酶Cdc34p，在線粒體上生成單泛素化的Fzo1蛋白，并在Fzo1蛋白48位點(diǎn)賴氨酸殘基進(jìn)一步泛素化，形成多聚泛素鏈，這樣多聚泛素化的Fzo1蛋白被26S蛋白酶體特異性識別、降解，生成單體泛素和多肽[14]。Drp1屬于動(dòng)力蛋白超家族，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中受線粒體外膜分子線粒體分裂因子和Fis1的招募轉(zhuǎn)位至線粒體外膜潛在的分裂位點(diǎn)，在此處多個(gè)Drp1分子圍繞線粒體外膜形成指環(huán)結(jié)構(gòu)，并通過三磷酸鳥苷分解提供能量逐漸縮小分子間距離，直至線粒體分裂[15]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Drp1基因編碼的蛋白是泛素連接酶有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting phase complex，APC)/CCdh1復(fù)合體的底物，Cdh1過表達(dá)可導(dǎo)致Drp1分子濃度下降及線粒體融合增加，用蛋白酶體抑制劑MG132治療，則恢復(fù)正常；同時(shí)剔除Cdh1和Drp1基因或單獨(dú)剔除Cdh1基因，線粒體斷裂增加的程度一致，說明Cdh1是通過Drp1發(fā)揮作用[16]。Drp1分子通過D-box結(jié)構(gòu)域與Cdh1結(jié)合，使APC/C復(fù)合體激活。除了泛素化酶以外，去泛素化酶USP (ubiquitin-specific protease) 30也與線粒體的形態(tài)有關(guān)，USP30為泛素特異性蛋白，位于線粒體外膜，Nakamura和Hivose[17]通過RNA干擾抑制USP30表達(dá)，發(fā)現(xiàn)線粒體體積增大，而細(xì)胞內(nèi)總線粒體分裂因子、Fis1、Drp1、mfn2蛋白表達(dá)水平未增加；重新導(dǎo)入U(xiǎn)SP30基序，線粒體形態(tài)并未恢復(fù)正常，但加入Drp1蛋白，線粒體則恢復(fù)正常。這表明UPS不僅僅通過靶蛋白的泛素化或去泛素化調(diào)控線粒體的形態(tài)，還可能通過改變靶蛋白的活性或空間構(gòu)象參與線粒體的形態(tài)調(diào)控。

2.3UPS與線粒體自噬線粒體自噬對維持線粒體的正常功能與數(shù)量乃至整個(gè)細(xì)胞生命活動(dòng)是至關(guān)重要的，目前線粒體自噬的分子機(jī)制還不清楚。Parkin是一個(gè)由465個(gè)氨基酸殘基組成的泛素連接酶，其主要結(jié)構(gòu)包括一個(gè)N端泛素樣結(jié)構(gòu)域，緊鄰富含4個(gè)半胱氨酸以及能結(jié)合鋅的RING(really-interesting-new-gene)結(jié)構(gòu)域，即RING0、RINGl、RING2和IBR(in between-RING)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，Parkin可直接介導(dǎo)線粒體自噬，而且Parkin基因突變被認(rèn)為是帕金森病重要的發(fā)病機(jī)制之一[18]。Chan等[6]用羰基氰化間氯苯腙和表達(dá)Parkin 的HeLa細(xì)胞S3細(xì)胞株共同孵育，1 h后，發(fā)現(xiàn)線粒體上Parkin的數(shù)量顯著增加，線粒體外膜蛋白豐度下降，其中下降最明顯為mfn1和mfn2，其次為陰離子電位通道蛋白；4 h，線粒體上Parkin繼續(xù)增加，上述蛋白降解速度減慢，自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白分子出現(xiàn)，線粒體主要聚集在細(xì)胞核周圍；12 h，線粒體碎片增加；24 h，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少；用蛋白酶體抑制劑可抑制上述過程，特別是在24 h加入可完全抑制線粒體自噬，而無Parkin表達(dá)的細(xì)胞則無上述變化。這表明Parkin泛素連接酶的活性是Parkin介導(dǎo)線粒體自噬所必需的，而且一些調(diào)控線粒體形態(tài)的重要分子參與自噬。多項(xiàng)研究表明，正常情況下Parkin處于自我抑制狀態(tài)，當(dāng)線粒體膜電位去極化時(shí)，磷酸酶張力蛋白誘導(dǎo)激酶1位于257位點(diǎn)的蘇氨酸發(fā)生自磷酸化獲得活性，使Parkin N端泛素樣結(jié)構(gòu)域上位于65位點(diǎn)的S絲氨酸發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致Parkin空間構(gòu)象發(fā)生變化形成同源二聚體，這種變化加強(qiáng)Parkin 泛素連接酶的活性并使Parkin轉(zhuǎn)位至線粒體；活化的Parkin使受損線粒體上的陰離子電位通道蛋白泛素化并被信號接頭蛋白p62/SQSTM1(sequestosome 1)識別，后者再與自噬相關(guān)蛋白8 (autophagy-related gene product 8,Atg8) 家族同源蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3連接，進(jìn)而啟動(dòng)線粒體的降解過程[19-21]。自分泌游動(dòng)因子受體(autocrine motility factor receptor，AMFR，gp78)，是一個(gè)相對分子質(zhì)量為78 000的七次跨膜螺旋糖蛋白，由N端的七次跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外的RING-H2膜體和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。gp78的N端糖基側(cè)鏈與多種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)越高，腫瘤的惡性程度越高，轉(zhuǎn)移傾向也越大。胞外的RING-H2膜體不但與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白降解有關(guān)還與線粒體自噬密切相關(guān)，F(xiàn)u等[22]報(bào)道，gp78過表達(dá)可使線粒體斷裂，線粒體內(nèi)OxPhosV蛋白丟失，線粒體自噬增加，加入蛋白酶體抑制劑MG132可逆轉(zhuǎn)上述變化；剔除gp78基因，羰基氰化間氯苯腙引起的線粒體自噬顯著減少；而在無Parkin表達(dá)的HEK293細(xì)胞，gp78介導(dǎo)的線粒體自噬依然發(fā)生，表明gp78介導(dǎo)的線粒體自噬與UPS有關(guān)，與Parkin無關(guān)。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，26S蛋白酶體亞單位20S可直接降解自噬標(biāo)志物L(fēng)C3，但加入p62則可抑制上述過程[23]。由此可見，線粒體的自噬是一個(gè)復(fù)雜的過程，UPS不但直接介導(dǎo)線粒體的自噬，還參與其調(diào)控。

3小結(jié)

目前有關(guān)UPS各組分對線粒體影響的研究較多，一些泛素連接酶，如MITOL、Parkin、SCF和APC/CCdh1對線粒體形態(tài)及功能的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用，與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。已有研究顯示，針對失常關(guān)鍵環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)藥物或基因靶標(biāo)，對疾病治療起到了良好的效果[24]。因此，進(jìn)一步深入研究UPS各組分調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)及功能的分子機(jī)制，對于疾病診斷和治療具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]Dye BT,Schulman BA.Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2007,36:131-150.

[2]Smalle J,Vierstra RD.The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway[J].Annu Rev Plant Biol,2004,55:555-590.

[3]Heo JM,Rutter J.Ubiquitin-dependent mitochondrial protein degradation[J].Int J Biochem Cell Biol,2011,43(10):1422-1426.

[4]Yonashiro R,Sugiura A,Miyachi M,etal.Mitochondrial ubiquitin ligase MITOL ubiquitinates mutant SOD1 and attenuates mutant SOD1-induced reactive oxygen species generation[J].Mol Biol Cell,2009,20(21):4524-4530.

[5]Cohen MM,Leboucher GP,Livnat-Levanon N,etal.Ubiquitin-proteasome-dependent degradation of a mitofusin,a critical regulator of mitochondrial fusion[J].Mol Biol Cell,2008,19(6):2457-2464.

[6]Chan NC,Salazar AM,Pham AH,etal.Broad activation of the ubiquitin-proteasome system by Parkin is critical for mitophagy[J].Hum Mol Genet,2011,20(9):1726-1737.

[7]Azzu V,Mookerjee SA,Brand MD.Rapid turnover of mitochondrial uncoupling protein 3[J].Biochem J,2010,426(1):13-17.

[8]Clarke KJ,Adams AE,Manzke LH,etal.A role for ubiquitinylation and the cytosolic proteasome in turnover of mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1) [J].Biochim Biophys Acta,2012,1817(10):1759-1767.

[9]Tran JR,Brodsky JL.The Cdc48-Vms1 complex maintains 26S proteasome architecture[J].Biochem J,2014,458(3):459-467.

[10]Heo JM,Livnat-Levanon N,Taylor EB,etal.A stress-responsive system for mitochondrial protein degradation[J].Mol Cell,2010,40(3):465-480.

[11]Braun S,Matuschewski K,Rape M,etal.Role of the ubiquitin-selective CDC48(UFD1/NPL4)chaperone (segregase) in ERAD of OLE1 and other substrates[J].EMBO J,2002,21(4):615-621.

[12]Rabinovich E,Kerem A,Frohlich KU,etal.AAA-ATPase p97/Cdc48p,a cytosolic chaperone required for endoplasmic reticulum-associated protein degradation[J].Mol Cell Biol,2002,22(2):626-634.

[13]Taylor EB,Rutter J.Mitochondrial quality control by the ubiquitin-proteasome system[J].Biochem Soc Trans,2011,39(5):1509-

1513.

[14]Escobar-Henriques M,Westermann B,Langer T.Regulation of mitochondrial fusion by the F-box protein Mdm30 involves proteasome-independent turnover of Fzo1[J].J Cell Biol，2006,173(5):645-650.

[15]Losón OC,Song Z,Chen H,etal.Fis1,Mff,MiD49,and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission[J].Mol Biol Cell,2013,24(5):659-667.

[16]Horn SR,Thomenius MJ,Johnson ES,etal.Regulation of mitochondrial morphology by APC/CCdh1-mediated control of Drp1 stability[J].Mol Biol Cell,2011,22(8):1207-1216.

[17]Nakamura N,Hirose S.Regulation of mitochondrial morphology by USP30,a deubiquitinating enzyme present in the mitochondrial outer membrane[J].Mol Biol Cell,2008,19(5):1903-1911.

[18]Vives-Bauza C，Przedborski S．Mitophagy：the latest problem for Parkinson′s disease[J].Trends Mol Med,201l,17(3):158-165.

[19]Wauer T,Komander D.Structure of the human Parkin ligase domain in an autoinhibited state[J].EMBO J,2013,32(15):2099-2112.

[20]Kondapalli C,Kazlauskaite A,Zhang N,etal.PINK1 is activated by mitochondrial membrane potential depolarization and stimulates Parkin E3 ligase activity by phosphorylating Serine 65[J].Open Biol,2012,2(5):120080.

[21]Geisler S，Holmstrom KM，Skujat D，etal.PINK1/Parkin mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1[J].Nat Cell Biol,2010,12(2):119-131.

[22]Fu M,St-Pierre P,Shankar J,etal.Regulation of mitophagy by the Gp78 E3 ubiquitin ligase[J].Mol Biol Cell,2013,24(8):1153-1162.

[23]Gao Z,Gammoh N,Wong PM,etal.Processing of autophagic protein LC3 by the 20S proteasome[J].Autophagy,2010,6(1):126-137.

[24]Zavrski I,Jakob C,Schmid P,etal.Proteasome:an emerging target for cancer therapy[J].Anticancer Drugs,2005,16(5):475-481.

Relationship between the Ubiquitin-Proteasome System and Mitochondrion

DOUZhong-xiaa,ZHANGXiao-meia,MENGXiao-boa，WANGJub.

(DepartmentofPediatrics,thePeople′sHospitaloftheInnerMongoliaAutonomousRegion,Hohhot010017,China)

Abstract：The ubiquitin-proteasome system(UPS) is a specific route of protein degradation in eukaryotic cells.Moreover，it has become clear that the UPS fulfills an important function in most aspects of eukaryotic biology,such as regulation of cell cycle,intracellular signaling,transcriptional contro1 and apoptosis.Any abnormality in UPS may lead to illnesses such as malignancies,neurodegenerative disorders,cardiovascular disease and diabetes.UPS components have become the research focus of many diseases.Recent studies demonstrated a close relationship between UPS and mitochondrion.Accumulating evidence shows that the UPS plays an essential role not only in mitochondrial protein quality controls and dynamics,but also in the initiation of mitochondrial mitophagy.

Key words:Ubiquitin-proteasome system； Mitochondrion； Cycle regulation； Signal transduction；

收稿日期：2014-12-16修回日期：2015-04-30編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.012

中圖分類號：R363； R34

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4258-03