海拔高度對(duì)冠心病患者EPCs數(shù)量及功能的研究

買(mǎi)超平，閻春生，哈小琴

· 論著 ·

海拔高度對(duì)冠心病患者EPCs數(shù)量及功能的研究

買(mǎi)超平，閻春生，哈小琴

目的探討不同海拔因素下，蘭州市（海拔：1520 m）與咸陽(yáng)市（海拔：386 m）冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┗颊咄庵苎獌?nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）數(shù)量變化。方法2014年4月至12月分別在蘭州軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科/體檢中心和咸陽(yáng)市中心醫(yī)院心內(nèi)科/體檢中心共納入96例。各選取冠心病患者24例為冠心病組，男性12例，女性12例，平均年齡（60.6±10.9）歲；健康體檢者24例為對(duì)照組，男性12例，女性12例，平均年齡（58.3±8.9）歲。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定入選者外周血EPCs數(shù)量。通過(guò)ELISA法測(cè)定其外周血血清中白介素8（IL-8）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、高同型半胱氨酸（HCY）、低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1a（SDF-1a）。熒光定量PCR檢測(cè)外周血單核細(xì)胞因子CXCR2 mRNA、CXCE4 mRNA、CXCR7 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果蘭州市冠心病組EPCs數(shù)量與hs-CRP濃度之間進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，呈負(fù)相關(guān)（r=-0.631，P＜0.05）。與對(duì)照組比較，蘭州市冠心病組HCY降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在咸陽(yáng)市，與對(duì)照組比較，冠心病組IL-8、HCY降低，VEGF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與蘭州市冠心病組比較，咸陽(yáng)市IL-8降低，VEGF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。在女性入選者中，蘭州市冠心病組較對(duì)照組HCY降低；與對(duì)照組比較，咸陽(yáng)市冠心病組IL-8升高，HIF-1α下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與蘭州市冠心病組比較，咸陽(yáng)市IL-8升高，HIF-1α降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與蘭州市比較，咸陽(yáng)市入選者CXCR2表達(dá)上調(diào)，為（0.91± 0.13） vs. （4.8±1.87），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論冠心病患者較健康人EPCs數(shù)量有所降低，低海拔地區(qū)健康人較高海拔地區(qū)數(shù)量增加。IL-8、VEGF、HCY、HIF-1a、SDF-1a、CXCR2因子對(duì)研究不同海拔及性別因素下EPCs功能情況有意義，前景廣闊。

海拔；冠心??；內(nèi)皮祖細(xì)胞

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑牟±頇C(jī)制十分復(fù)雜，與家族遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷能夠加重動(dòng)脈粥樣硬化并且與冠心病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在組織缺血及血管損傷時(shí)動(dòng)員入血，參與微血管的生成及血管內(nèi)皮的修復(fù)。Schmidt-Lucke等[1]研究發(fā)現(xiàn)，EPCs數(shù)量的減少是動(dòng)脈粥樣硬化患者疾病發(fā)展的預(yù)測(cè)因子之一；Eizawa等[2]比較分析了循環(huán)EPCs的數(shù)量，穩(wěn)定型心絞痛患者EPCs數(shù)目降低而不穩(wěn)定型心絞痛患者循環(huán)EPCs卻升高。大多數(shù)研究數(shù)據(jù)表明，EPCs數(shù)量越多，心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)及死亡率就越低[3-5]。許多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子及內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡體都可影響EPCs的動(dòng)員、歸巢、增殖、分化、遷移和凋亡[6]。而不同海拔高度情況下冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的變化情況，國(guó)內(nèi)外研究較少。本研究檢測(cè)了不同海拔高度下冠心病患者EPCs數(shù)量及功能情況。

1 資料與方法

1.1 研究和對(duì)象2014年4月至12月分別在蘭州軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科/體檢中心和咸陽(yáng)市中心醫(yī)院心內(nèi)科/體檢中心共納入96例。各選取冠心病患者24例為冠心病組，男性12例，女性12例，平均年齡（60.6±10.9）歲；健康體檢者24例為對(duì)照組，男性12例，女性12例，平均年齡（58.3±8.9）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為長(zhǎng)住居民（＞10年）；冠心病患者行冠狀動(dòng)脈造影或心臟CTA檢查明確診斷為冠心病，標(biāo)準(zhǔn)參考2009年經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療指南[7]，每個(gè)冠狀動(dòng)脈病變至少采集2個(gè)相互垂直的投視角圖像，直徑狹窄≥50%病變則認(rèn)為有臨床意義。排除合并瓣膜性心臟病、心肌病、糖尿病、急慢性感染、外傷、潰瘍、視網(wǎng)膜病、腫瘤、近期外科手術(shù)、近3個(gè)月發(fā)生急性心肌梗死、急性心功能不全等。

1.2 方法

1.2.1 EPCs數(shù)量的測(cè)定采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD45、CD34+、KDR+、EPCs的比例。經(jīng)前臂靜脈抽取外周靜脈血5 ml肝素抗凝，取200μl加入EP管中，再分別加入5μl FITC標(biāo)記的CD45抗體，PE標(biāo)記的KDR抗體，APC標(biāo)記的CD34抗體。每個(gè)樣本設(shè)立陰性對(duì)照，只加CD45抗體?；靹蚝笫覝乇芄夥跤?0 min后每管中再加入6 ml紅細(xì)胞裂解液避光反應(yīng)15 min，充分溶解紅細(xì)胞離心后棄上清液再加入500 μl磷酸緩沖液，最后上流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè)空腹抽取外周靜脈血，肝素抗凝，檢測(cè)總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇。利用OLYMPUS-5421全自動(dòng)生化分析儀，采用免疫散色比濁法測(cè)定血清中C反應(yīng)蛋白（CRP）含量。

1.2.3 細(xì)胞因子和同型半胱氨酸檢測(cè)入選病例均抽取空腹靜脈血5 mL，3000 rpm離心5 min后吸取血清，置于-70℃保存。成批檢測(cè)，使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法），試劑盒購(gòu)自Sigma公司，檢測(cè)各樣本血清中白介素8（IL-8）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1a（SDF-1a）、同型半胱氨酸（HCY），操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)得吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各樣本血清中細(xì)胞因子的濃度。

1.2.4 檢測(cè)單核細(xì)胞趨化因子受體2（CXCR2）、趨化因子受體4（CXCR4）、趨化因子受體7（CXCR7） mRNA相對(duì)表達(dá)量 在Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中將CXCR2、CXCR4（NM-022205.3）、C X C R 7（N M-0 5 3 3 5 2.1）、G A P D H（M-017008.3）的核苷酸序列查找出來(lái)，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物。序列如下：CXCR2上游引物：5’-TCGCCGTCGTGCTC ATCTTCC-3’，下游引物：5’-GGCGCTCACAC GTCTCCTGGA-3’。

CXCR4上游引物：5’-GGGTTGGTAAT CCTGGTC-3’， 下游引物：5’-ATGATG TGCTGGAACTGG-3’； CXCR7上游引物：5’-AACCTGGGAACTACTCGG -3’，下游引物：5’-CAAGACGCAGACAACACG-3’。樣本抗凝處理后立刻按照密度梯度離心法提取單核細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，氯仿抽提，異丙醇乙醇沉淀洗滌后，用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過(guò)的水溶解RNA測(cè)定RNA OD值，紫外分光光度計(jì)算出濃度[1000/OD值（260 nm～280 nm）]，根據(jù)TAKALA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存，以cDNA為模板按照反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。最后72 ℃ 10 min，降溫到4 ℃。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置副孔，取平均CT值，根據(jù)公式：ΔΔCT＝（CT目的基因－CT內(nèi)參）冠心病組－（CT目的基因－CT內(nèi)參）健康組；算出倍數(shù)＝2－ΔΔCT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘭州、咸陽(yáng)市入選者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量比較與對(duì)照組比較，蘭州市與咸陽(yáng)市冠心病組EPCs數(shù)量略有增加，但對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。蘭州市對(duì)照組和冠心病組與咸陽(yáng)市比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（表1）。

2.2 蘭州市冠心病組EPCs數(shù)量與hs-CRP水平相關(guān)性分析蘭州市冠心病組EPCs數(shù)量與高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）濃度之間進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，呈負(fù)相關(guān)（r=-0.631，P＜0.05）。

2.3 男性入選者IL-8、VEGF、HCY、SDF-1a、HIF-1α檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，蘭州市冠心病組HCY降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在咸陽(yáng)市，與對(duì)照組比較，冠心病組IL-8、HCY降低，VEGF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與蘭州市冠心病組比較，咸陽(yáng)市IL-8降低，VEGF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表2）。

2.4 女性入選者IL-8、VEGF、HCY、SDF-1a、HIF-1α檢測(cè)結(jié)果在女性入選者中，蘭州市冠心病組較對(duì)照組HCY降低；與對(duì)照組比較，咸陽(yáng)市冠心病組IL-8升高，HIF-1α下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與蘭州市冠心病組比較，咸陽(yáng)市IL-8升高，HIF-1α降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表3）。

2.4 單核細(xì)胞中CXCR2、CXCR4和CXCR7的mRNA表達(dá)檢測(cè)與蘭州市比較，咸陽(yáng)市入選者CXCR2表達(dá)上調(diào)，為（0.91±0.13） vs. （4.8± 1.87），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表4）。

3 討論

EPCs數(shù)量下降及功能減退與冠心病發(fā)病有關(guān)。有研究表明，EPC數(shù)量減少是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其在內(nèi)皮修復(fù)過(guò)程中起著重要作用。Zhang Q等[8]認(rèn)為EPCs的數(shù)量水平可預(yù)測(cè)心血管不良事件。CD34/KDR雙陽(yáng)性是檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的主要方法[9]。方葉青等[10]發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血EPCs數(shù)量較正常人明顯減少，而且形成細(xì)胞集落數(shù)、細(xì)胞的增殖能力也明顯降低。

CRP是一種急性期反應(yīng)蛋白，可以反應(yīng)炎癥水平，能激活補(bǔ)體、促進(jìn)吞噬并具有其他的免疫調(diào)控作用[11]。陳良友等[12]研究表明，冠心病患者CRP和血漿HCY均高于對(duì)照組。IL-8具有趨化作用，可使大量T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞出現(xiàn)在斑塊破裂的部位，對(duì)粥樣斑塊的形成和破裂有重要作用。唐任光等[13]發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清IL-8水平高于正常對(duì)照組。王進(jìn)等[14]認(rèn)為EPCs數(shù)量與VEGF濃度呈正相關(guān)。同時(shí)Strakova J 等[15]認(rèn)為血漿HCY水平升高也是冠心病獨(dú)立危險(xiǎn)因素。HIF-1 α是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵因子之一，由組織中分子氧水平的改變所誘導(dǎo)，能激活許多缺氧反應(yīng)性基因的表達(dá)，使機(jī)體產(chǎn)生一系列低氧適應(yīng)反應(yīng)[16-18]。

EPCs介導(dǎo)的血管生成過(guò)程受許多生化因子的調(diào)控，一些研究認(rèn)為CXCR7能夠促進(jìn)EPCs的增殖、粘附、趨化和激活下游信號(hào)分子[19]。Hristov M等[20]發(fā)現(xiàn)CXCR2及其配體CXC趨化因子也參與了EPCs的動(dòng)員、增殖、遷移，促進(jìn)了EPCs的黏附功能。

表1 外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（CD34、KDR雙陽(yáng)性率）數(shù)量比較

表2 蘭州市及咸陽(yáng)市男性冠心病組與對(duì)照組比較（ng/L）

表3 蘭州市及咸陽(yáng)市女性冠心病組與對(duì)照組比較（ng/L）

冠心病的病理機(jī)制十分復(fù)雜，且與危險(xiǎn)因素、家族遺傳、環(huán)境等方面均有關(guān)，而國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)冠心病的具體機(jī)制尚未達(dá)成共識(shí)。本研究通過(guò)測(cè)量細(xì)胞因子的水平以及表達(dá)，分析可能的致病機(jī)制。同時(shí)，本研究還存在一些局限性，比如由于患者的配合程度和經(jīng)費(fèi)條件所限，兩地樣本的提取數(shù)量太少。另外，關(guān)于海拔因素下冠心病患者EPCs的功能變化文獻(xiàn)較少，選擇測(cè)定因子的實(shí)驗(yàn)研究處于探索階段。

表4 單核細(xì)胞中CXCR2、CXCR4和CXCR7的mRNA表達(dá)

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Quantity and function of endothelial progenitor cells in patients with coronary heart disease influenced by different altitude factors

MAI Chao-ping*, YAN Chun-sheng, HA Xiao-qin.*College of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China.

YAN Chun-sheng, E-mail: yanchsh@lzu.edu.cn

ObjectiveTo discuss the quantity changes of endothelial progenitor cells (EPCs) in patients with coronary heart disease (CHD) influenced by different altitude factors (altitude=1520 m in Lanzhou City and altitude=386 m in Xianyang City).MethodsThe cases (n=96) were chosen from Lanzhou City and Xianyang City from Apr. 2014 to Dec. 2014, and then 24 CHD patients (male 12, female 12 and average age=60.6±10.9) were chosen respectively from Lanzhou City and Xianyang City as Lanzhou CHD group and Xianyang CHD group, and 24 healthy controls (male 12, female 12 and average age=58.3±8.9) were chosen respectively from Lanzhou City and Xianyang City as Lanzhou control group and Xianyang control group. The quantity of EPCs of peripheral blood (PB) was detected by using flow cytometer. The changes of PB serum interleukin-8 (IL-8), vascular endothelial growth factor (VEGF), homocysteine (Hcy), hypoxia inducible factor-1a (HIF-1α) and stromal cell derived factor 1a (SDF-1a) were detected by using ELISA. The expressions of PB mononuclear monocytes-CXCR2 mRNA, CXCE4 mRNA, CXCR7 mRNA were detected by using RT-PCR.ResultsIn Lanzhou CHD group, Spearman correlation analysis showed that EPCs quantity was negatively related to hs-CRP concentration (r=-0.631, P＜0.05). Compared with Lanzhou control group, Hcy decreased in Lanzhou CHD group (P＜0.05). Compared with Xianyang control group, IL-8 and Hcy decreased and VEGF increased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). Compared with Lanzhou CHD group, IL-8 decreased and VEGF increased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). Among woman objects, Hcy decreased in Lanzhou CHD group compared with Lanzhou control group. Compared with Xianyang control group, IL-8 increased and HIF-1α decreased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). Compared with Lanzhou CHD group, IL-8 increased and HIF-1α decreased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). The expression of CXCR2 was up-regulated in Lanzhou group compared with Xianyang group [(0.91±0.13) vs. (4.8±1.87), P＜0.05].

R541.4

A

1674-4055(2015)06-0754-04

2015-06-26）

（責(zé)任編輯：姚雪莉）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(81060015);甘肅省自然基金項(xiàng)目(110TRJ2A114)

730000 蘭州,蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所(買(mǎi)超平,閻春生);蘭州軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科(哈小琴)

閻春生,E-mail:yanchsh@lzu.edu.cn;哈小琴,E-mail:18294437996@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2015.06.09