NF-κB和VEGF在破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤瘤壁的表達(dá)及相關(guān)性研究

曾 林

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

NF-κB和VEGF在破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤瘤壁的表達(dá)及相關(guān)性研究

曾 林

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

目的 探討顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者破裂瘤壁組織中核因子κB(NF-κB)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)水平及相互關(guān)系。方法 對(duì)29例破裂顱內(nèi)囊性動(dòng)脈瘤標(biāo)本(動(dòng)脈瘤組)和30例腦外傷手術(shù)切除的顳極及顳葉皮質(zhì)動(dòng)脈血管標(biāo)本(對(duì)照組)分別進(jìn)行HE染色光鏡下觀察,并采用免疫組化染色法檢測(cè)2組標(biāo)本組織中NF-κB及VEGF的表達(dá)情況，采用RT-PCR法檢測(cè)2組標(biāo)本組織中NF-κBmRNA及VEGFmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 動(dòng)脈瘤組NF-κB、VEGF陽性表達(dá)率及VEGFmRNA、NF-κBmRNA值均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)。動(dòng)脈瘤組NF-κB、VEGF陽性表達(dá)情況具有顯著相關(guān)性(r=0.909，P=0.034)。結(jié)論NF-кB、VEGF在顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤組織中高表達(dá)，并且二者間具有一定的正相關(guān)關(guān)系。

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤；核因子κB；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是腦血管動(dòng)脈管壁病理性局部凸起產(chǎn)生的，是造成腦血管出血的主要原因之一，其發(fā)病率在腦血管疾病中僅次于腦血栓及高血壓腦出血，而病死率高達(dá)70%，是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展和破裂的機(jī)制不明確，對(duì)該病的預(yù)防和治療造成了極大阻礙。核因子кB(NF-кB)是一種促炎癥基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和一些炎性相關(guān)酶類等的表達(dá)[1]；而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是促血管生長(zhǎng)最強(qiáng)的調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，通過炎性浸潤(rùn)和新生血管生成等機(jī)制促進(jìn)粥樣硬化損傷的進(jìn)展[2]。二者在腦血管動(dòng)脈壁表達(dá)異?？赡苁橇霰谘仔苑磻?yīng)以及病理學(xué)改變的重要原因。本研究通過比較破裂顱內(nèi)囊性動(dòng)脈瘤標(biāo)本與腦外傷手術(shù)切除動(dòng)脈血管標(biāo)本的HE染色、免疫組化染色及NF-кB mRNA及VEGF mRNA的表達(dá)差異，研究NF-кB及VEGF在人顱內(nèi)動(dòng)脈瘤瘤壁中的表達(dá)情況，探討顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1一般資料 選取本院2011年11月—2014年12月收集的29例破裂顱內(nèi)囊性動(dòng)脈瘤標(biāo)本為動(dòng)脈瘤組,術(shù)前均經(jīng)過CT、MRI檢查，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診；男16例,女13例；年齡27～55(44.62±7.94)歲；既往合并高血壓16例，高血脂14例，糖尿病10例，吸煙史13例；動(dòng)脈瘤直徑(3.7±2.1)mm;大腦前動(dòng)脈動(dòng)脈瘤8例，中動(dòng)脈動(dòng)脈瘤6例，前交通動(dòng)脈瘤8例，后交通動(dòng)脈瘤5例，小腦后小動(dòng)脈瘤2例。選擇30例腦外傷手術(shù)切除的顳極及顳葉皮質(zhì)動(dòng)脈血管標(biāo)本作為對(duì)照組,均證實(shí)為非血管性病變;男18例,女12例；年齡21～57(45.27±10.29)歲。2組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，均排除術(shù)前因顱內(nèi)其他類型腫瘤實(shí)施放療或化療者。

1.2 方法 2組樣本均在無菌條件下獲得，用生理鹽水沖洗后，立即放入-80 ℃冰箱保存。樣本經(jīng)甲醛固定后，分別以70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇中梯度脫水2～3 min，浸入無水乙醇Ⅰ中5 min、無水乙醇Ⅱ中10 min，然后浸入二甲苯Ⅰ、甲苯Ⅱ中分別透明10 min，最后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度4～5 μm。

1.2.1 HE染色 切片依次以二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟10 min后，浸入無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ中10 min；然后依次用95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇復(fù)水2～3 min，切片用蒸餾水中清洗后浸入蘇木素染液中染色2～5 min，流動(dòng)水沖洗5 min后以0.5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，再以流動(dòng)水清洗2 min后以0.5%伊紅水溶液染色5 min，最后依次浸入80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ靜置幾秒，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中靜置2～3 min后，用中性樹膠封片。

1.2.2 免疫組化染色 ①石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，染色方法按試劑盒說明進(jìn)行；②PBS漂洗3次，每次5 min，滴加30 mL/L過氧化氫室溫封閉10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；③加入修復(fù)液后微波熱修復(fù)10 min，PBS漂洗3次，每次5 min；④滴加VEGF或NF-κB一抗，抗體濃度為1∶1 000，37.5 ℃孵育30 min，45 ℃過夜；⑤滴加生物素標(biāo)記抗的二抗，37.5 ℃孵育20 min，PBS沖洗；⑥滴加SABC工作液，37.5 ℃孵育30 min；⑦PBS沖洗，DAB 顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)中用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知VEGF和NF-κB陽性表達(dá)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織作為陽性對(duì)照。

1.2.3 RT-PCR法 取100 mg樣本放入消毒后的EP管中，剪碎后用DEPC水沖洗，加入1.0 mL Trizol 乳化20～30 s；混勻后置于15～30 ℃環(huán)境下5 min，使核蛋白解離，待組織塊完全解離后，加入0.2 mL氯仿震蕩，室溫靜置15～30 min后以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min；離心后取上清液1.5 mL加異內(nèi)醇0.5 mL，充分震蕩后室溫靜置15 min，12 000 r/min離心10 min后棄上清；沉淀加75%乙醇1 mL后以7 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，重復(fù)步驟3后短暫離心，吸取殘留乙醇后使沉淀真空干燥；DEPC-treated water 20～50 μL溶解沉淀并以槍頭打勻，55～60 ℃孵育10 min后保存于-70 ℃冰箱；準(zhǔn)備0.65 mL EP管，依次加入模板RNA 11 μL及O1igo(dT)18Primer 0.5 μg/μL，輕輕混勻后離心3～5 s，70 ℃水浴5 min，冰浴30 s，離心3～5 s；加入5×Reaction Buffer 4 μL、RNase Inhibitor(10 IU/μL)1 μL和dNTP Mix(10 mol/L)2 μL，終體積為20 μL；42 ℃水浴60 min；70 ℃水浴10 min，冷凍保存。按文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行PCR。

1.3 免疫組化的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) NF-кB陽性細(xì)胞為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色著色，VEGF陽性為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色，按照著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，褐色3分；顯微鏡下染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；2個(gè)得分項(xiàng)目相加為最終評(píng)分，總分<3分為(-)，即陰性表達(dá)；3分為(+)，弱陽性表達(dá)；4分為()，中陽性表達(dá)；5分為()，強(qiáng)陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 對(duì)照組動(dòng)脈各層結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮完整，內(nèi)彈力膜存在，中膜平滑肌細(xì)胞有序排列,見圖1;動(dòng)脈瘤組的血管壁可見平滑肌細(xì)胞減少，排列紊亂，纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn),見圖2。

圖1 對(duì)照組HE染色結(jié)果

圖2 動(dòng)脈瘤組HE染色結(jié)果

2.2 免疫組化染色結(jié)果 動(dòng)脈瘤組NF-κB、VEGF陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)，見表1及表2。動(dòng)脈瘤組NF-κB、VEGF陽性表達(dá)情況具有顯著的相關(guān)性(r=0.909，P=0.034)，見表3。

表1 2組NF-κB陽性表達(dá)情況 例(%)

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01。

表2 2組VEGF陽性表達(dá)情況 例(%)

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01。

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 動(dòng)脈瘤組VEGF mRNA、NF-κB mRNA值顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表4。

表3 2組VEGF、NF-κB陽性表達(dá)相關(guān)性 例

表4 2組VEGF mRNA、NF-κB mRNA檢測(cè)結(jié)果比較

3 討 論

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是一種多發(fā)于中老年人群的致殘率和致死率都極高的腦血管疾病，該病在早期無明顯癥狀，隨著病情發(fā)展，一旦因瘤體破裂而突然發(fā)生出血，病情就會(huì)急劇惡化，患者通常預(yù)后不良[4]，因此對(duì)該病的早期診斷和干預(yù)就成為降低病死率、改善預(yù)后的重要途徑[5]。但目前醫(yī)學(xué)界尚無統(tǒng)一明確的預(yù)防和診斷方法，因此對(duì)于該病發(fā)病機(jī)制的研究以及在此基礎(chǔ)上探索防治顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的有效方法，就成為當(dāng)前攻克這一疾病的重中之重。

先天性血管壁發(fā)育不良和血管壁獲得性退行性病變以及兩者的共同作用是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制的主要論點(diǎn)[6]，除此之外，高血壓、飲酒、創(chuàng)傷、感染等因素與動(dòng)脈瘤形成也有一定聯(lián)系。近幾年，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤與血管退行性病變相關(guān)的學(xué)說開始被提出，認(rèn)為該病的發(fā)生與動(dòng)脈粥樣硬化、衰老等因素有緊密聯(lián)系，根據(jù)動(dòng)脈粥樣硬化、衰老的發(fā)生機(jī)制推斷，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的產(chǎn)生可能與細(xì)胞凋亡異常、細(xì)胞外基質(zhì)的降解及擴(kuò)張性重塑、免疫和炎癥損傷等過程有關(guān)[7]，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成、生長(zhǎng)與破裂從本質(zhì)上講就是血管重塑的過程，各種因子引起的炎癥反應(yīng)貫穿病變始終，因此對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)的降解及擴(kuò)張性重塑、免疫和炎癥損傷等細(xì)胞因子的監(jiān)測(cè)可能對(duì)于該病的早期診斷和預(yù)防有十分重要的意義[8]。

NF-кB是一種在免疫、炎癥、細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮調(diào)控作用的細(xì)胞因子，其通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和一些炎性相關(guān)酶類等的表達(dá)參與炎癥反應(yīng)調(diào)控，其異常激活與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[9]。Aoki等[10]研究發(fā)現(xiàn)，NF-кB在腦動(dòng)脈瘤形成初期被激活，同時(shí)對(duì)下游基因的表達(dá)起上調(diào)作用，通過人為干預(yù)減少NF-кB后，腦動(dòng)脈瘤的發(fā)生率明顯降低。有研究顯示[11]，正常動(dòng)脈壁無炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而在產(chǎn)生動(dòng)脈瘤的血管壁中卻存在大量炎性細(xì)胞，且這一變化存在于動(dòng)脈瘤形成的整個(gè)過程，表現(xiàn)在免疫球蛋白和巨噬細(xì)胞的大量浸潤(rùn)[12]，且單核巨噬細(xì)胞在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤壁中廣泛浸潤(rùn)，而并非僅僅存在于動(dòng)脈粥樣硬化的病灶處，炎性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可誘導(dǎo)血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分泌發(fā)生改變，從而破壞動(dòng)脈血管壁[13]。VEGF是促血管生長(zhǎng)作用最強(qiáng)的調(diào)節(jié)因子，通過增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)血管發(fā)生，增加血管通透性[14]。NF-кB高表達(dá)對(duì)血管壁的破壞和VEGF高表達(dá)對(duì)損傷血管的重塑共同促使了動(dòng)脈瘤的形成[15]。本研究結(jié)果顯示，動(dòng)脈瘤組NF-кB及VEGF陽性表達(dá)率及NF-кB mRNA和VEGF mRNA值均明顯高于對(duì)照組。

綜上所述，NF-кB和VEGF的異常表達(dá)與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生關(guān)系密切，對(duì)其表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)或能作為該病早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的指標(biāo)，對(duì)于疾病的治療也提供了一定思路方法。但上述細(xì)胞因子在該病發(fā)病機(jī)制中扮演的角色尚不清楚，其異常表達(dá)的原因和控制方法仍然未知，因此需要進(jìn)一步廣泛、深入研究。

[1] 李建峰.基質(zhì)金屬蛋白酶-9和核因子-кB在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的表達(dá)[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2014,24(13):37-39

[2] 鄒文萍,唐國強(qiáng),李光明.VEGF及其受體的生物學(xué)特性[J].四川生理科學(xué)雜志,2012,34(3):123-126

[3] 韓磊.破裂顱內(nèi)囊性動(dòng)脈瘤NF-KB、VEGF的相關(guān)性表達(dá)與瘤壁血管重塑[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2008

[4] 閆傳真,關(guān)靖宇.重癥蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦脊液細(xì)胞因子與預(yù)后的相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代儀器與分析,2014,5(3):34-36

[5] He ZZ,Huang GF.Effect of nuclear factor-Kappa B on pathogenesis of intracranial aneurysm[J].Practical Journal of Clinical Medicine,2011,8(5):185-188

[6] Zhao SH,Li LM,Ma WQ,et al.Expression of the matrix metalloproteinase-2 and 9 in intracranial aneurysms[J].Chinese Journal of Cerebrovascular Diseases,2013,10(1):18-21

[7] 周健，翟寶進(jìn)，焦德讓.顱內(nèi)動(dòng)脈瘤與細(xì)胞外基質(zhì)[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，16(4)：478-480

[8] 李明昌，石忠松，黃正松，等.顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織免疫和炎癥相關(guān)差異表達(dá)基因的研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2006，5(9)：911-913

[9] 朱佳蕾,鄧夏珩,高麗,等.白黎蘆醇通過核因子-кB信號(hào)通路抑制腦缺血基質(zhì)金屬蛋白酶功能上調(diào)[J].中國老年學(xué)雜志，2013,33(5):1073-1075

[10] Aoki T,Kataoka H,Morimoto M,et al.Macrophage-derived matrix metalloproteinase-2 and-9 promote the progression of cerebral and aneurysms in rats[J]． Strok,2007,38(1):162-169

[11] Vlak MH,Algra A,Brandenburg R,et al.Prevalence of unruptured intracranial aneurysms,with emphasis on sex,age,comorbodity,country,and time period:a systematic review and meta-analysis[J].Lancet Neurol,2011,1(10):626-636

[12] 梅其勇,白如林,黃承光,等.巨噬細(xì)胞參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2014,9(1):56-58

[13] Kanematsu Y,Kanematsu M,KURIHARA C,et al.Critical roles of macrophages in the formation of intracranial aneurysm[J].Stroke,2011,42(1):173-178[14] 呂倩,王昌明,蔣明,等.HIF-1ɑ和VEGF在大鼠COPD中的表達(dá)及與肺血管重構(gòu)的關(guān)系研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2012,28(6):772-777

[15] Naggara ON,White PM,Guilbaert F,et al.Endovascular treatment of intracranial unruptured aneurysms：systematic review and meta-analysis of the literature on safety and efficacy[J].Radiology,2010,256(13)：887-897

Expression of NF-kB and VEGF in ruptured intracranial aneurysm wall and correlation study

ZENG Lin

(Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,China)

Objective It is to explore the expression of nuclear factor kappa B (tissue NF- kappa B) and vascular endothelial growth factor (VEGF)in ruptured intracranial aneurysm wall and the correlation between them.Methods 29 cases of ruptured intracranial aneurysms specimens (aneurysm group) and 30 cases of resection of brain trauma operation of the temporal pole and cortex of temporal lobe artery specimens (control group) were collected and observed under light microscopy after HE staining.The expression of NF-κB and VEGF were detected by immunohistochemistry staining method,and the expression of NF-κB mRNA and VEGF mRNA were detected by RT-PCR method in the specimens in both groups.Results The positive expression rates of NF-κB and VEGF and the values of NF-κB mRNA and VEGF mRNA were significantly higher in aneurysm group than that of the control group (P<0.05).There was significant correlation between the expression of NF-κB and VEGF (r=0.909,P=0.034).Conclusion There are high expression of NF-κB and VEGF in the aneurysm rupture in intracranial tissues,and the expressions are positive correlated.

intracranial aneurysm; nuclear factor kappa B; vascular endothelial growth factor

曾林，男，研究生，研究方向?yàn)轱B內(nèi)動(dòng)脈瘤診治。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.13.008

R543.5

A

1008-8849(2015)13-1391-04

2014-12-24