曲美他嗪對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷保護(hù)作用研究

梁俊文，郭志強(qiáng)，林嘉敏，鄧啟垣，何文飛

(廣東省佛山市南海區(qū)第二人民醫(yī)院，廣東 佛山 528251)

曲美他嗪對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷保護(hù)作用研究

梁俊文，郭志強(qiáng)，林嘉敏，鄧啟垣，何文飛

(廣東省佛山市南海區(qū)第二人民醫(yī)院，廣東 佛山 528251)

目的 探討曲美他嗪對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法將健康雄性Wistar大鼠60只隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組、實(shí)驗(yàn)C組,每組12只。對(duì)照組采用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng);模型組和實(shí)驗(yàn)各組采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，于第6周一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(FTZ )30 mg/kg，注射后72 h，篩選血糖水平連續(xù)2次高于11.1 mmol/L的大鼠，繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)6周，同時(shí)實(shí)驗(yàn)A組、B組、C組分別腹腔注射10,30,90 mg/(kg·d)曲美他嗪干預(yù)6周。末次給藥12 h后，觀察比較5組大鼠的心功能、心肌酶譜、TGF-β1蛋白及TGF-β1mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 模型組的肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、TGF-β1、丙二醛(MDA)、TGF-β1mRNA水平均顯著高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)各組(P均<0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)、miR-21水平顯著低于實(shí)驗(yàn)各組和對(duì)照組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)各組CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平隨著曲美他嗪用量的增加而逐步下降，SOD、miR-21水平則顯著升高，實(shí)驗(yàn)C組的CK、LDH、TGF-β1、 MDA、SOD、TGF-β1mRNA、miR-21水平與對(duì)照組最接近，但CK、LDH、MDA、TGF-β1mRNA水平仍高于對(duì)照組(P均<0.05)。模型組FS、LVEF、IRVT、E/A均顯著低于實(shí)驗(yàn)各組和對(duì)照組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)各組的E/A、FS、LVEF、IRVT均低于對(duì)照組(P均<0.05),且隨著曲美他用量的增加上述各指標(biāo)逐步接近對(duì)照組。結(jié)論 曲美他嗪可以通過(guò)調(diào)控MAPK-microRNA通路改善心肌酶、心功能等指標(biāo)，保護(hù)心肌，減輕心室重構(gòu),隨著劑量增加效果更加顯著。

曲美他嗪；糖尿??；心肌??；心肌損傷

糖尿病性心肌病是指發(fā)生于糖尿病患者的非高血壓性心臟病、心臟瓣膜病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及其他心臟疾病。糖尿病性心肌病患者多因代謝紊亂或微血管病變出現(xiàn)的心肌廣泛性灶性壞死而發(fā)病，發(fā)病患者將出現(xiàn)亞臨床心功能障礙，并逐步發(fā)展為心律失常、心力衰竭、心源性休克等，嚴(yán)重時(shí)可誘使患者死亡[1]。糖尿病性心肌病主要以藥物治療為主，包括控制血糖，降血壓、血脂，抗心絞痛、心力衰竭治療等[2]?？剐牧λソ咧委熓翘悄虿⌒孕募〔〉暮诵膬?nèi)容，常用藥物有曲美他嗪、非洛地平緩釋片等。曲美他嗪在改善糖尿病性心肌病患者血糖、血壓水平方面具有顯著療效，但對(duì)心肌損傷的療效及其作用機(jī)制臨床尚無(wú)定論。故本研究探討了曲美他嗪對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雌性Wistar大鼠60只，4～5周齡，體質(zhì)量138～152(144.4±4.4)g，中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2004-0011,飼養(yǎng)于25 ℃的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由飲食進(jìn)水，光照周期12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品 BIORAD imar全自動(dòng)酶標(biāo)儀，貝克曼庫(kù)爾特AU5800全自動(dòng)生化分析儀，海精科科學(xué)儀器有限公司提供的722分光光度計(jì)，Odyssey 掃描儀；蘇州拜吉氏生物科技有限公司生產(chǎn)的STZ試劑，上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)的ISO試劑，南京建成生物工程研究所提供的乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒、磷酸肌酸激酶(CPK)試劑盒，Gaithersburg MD USA提供的鼠抗羊GAP-DH單抗、鼠抗人Caveolin-3單抗DH；鏈脲佐菌素(FTZ ，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022516 )，高糖高脂飼料(廣西平南制藥廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字B20020169 )，戊巴比妥鈉(吉林省中研藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H22025189 )，曲美他嗪(施維雅(天津)制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20055465)。

1.3 動(dòng)物分組及造模方法 采用隨機(jī)數(shù)值表法將健康成年雌性Wistar大鼠60只分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組、實(shí)驗(yàn)C組,每組12只。對(duì)照組采用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)6周；模型組和實(shí)驗(yàn)各組采用高糖高脂飼料(大鼠基礎(chǔ)飼料68.8%、蔗糖10%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1%、膽鹽0.2%)喂養(yǎng)6周，在第6周一次性腹腔注射FTZ 30 mg/kg，注射后72 h測(cè)定空腹血糖，如血糖水平連續(xù)2次高于11.1 mmol/L視為構(gòu)建糖尿病模型成功。隨后，繼續(xù)用高糖高脂飼料喂養(yǎng)造模大鼠6周，同時(shí)實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組、實(shí)驗(yàn)C組分別給予10，30，90 mg/(kg·d)的曲美他嗪干預(yù)6周；對(duì)照組繼續(xù)采用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)6周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) ①末次給藥12 h后，采用飛利浦公司生產(chǎn)的iE33型彩色 Deppler超聲儀檢測(cè)5組大鼠心功能。②頸靜脈采血檢測(cè)肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，CK、LDH選用全自動(dòng)生化分析儀按儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，MDA、SOD采用ELISA法檢測(cè)。③選用脊椎脫臼法處死大鼠，取出心臟，沖洗，減去包膜、血管及心房組織，稱(chēng)質(zhì)量，于左心室長(zhǎng)軸中點(diǎn)切取2 mm后的左心室截面組織，置于甲醛內(nèi)，24 h后包埋，其余組織編號(hào)后冰凍保存。選用免疫組化分析方法檢測(cè)TGF-β1在心肌內(nèi)的表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取100 mg心肌組織，勻漿后提取RNA，選用分光光度儀檢測(cè)RNA濃度。PCR擴(kuò)增后，選用BIORAD imar全自動(dòng)酶標(biāo)儀進(jìn)行分析并計(jì)算TGF-β1mRNA、miR-21表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1各組血清及心肌檢測(cè)指標(biāo)比較 模型組CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平均顯著高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)各組(P均<0.05)，SOD、miR-21水平顯著低于實(shí)驗(yàn)各組和對(duì)照組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)各組CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平隨著曲美他嗪用量的增加而逐步下降，SOD、miR-21水平則顯著升高，實(shí)驗(yàn)C組的CK、LDH、TGF-β1、 MDA、SOD、TGF-β1mRNA、miR-21水平與對(duì)照組最接近，但CK、LDH、MDA、TGF-β1mRNA水平仍高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組心功能指標(biāo)比較 模型組的FS、LVEF、IRVT、E/A值均顯著低于實(shí)驗(yàn)各組和對(duì)照組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)各組的FS、LVEF、IRVT、E/A值均低于對(duì)照組(P均<0.05),且隨著曲美他嗪用量的增加上述各指標(biāo)逐步接近對(duì)照組。見(jiàn)表2。

3 討 論

糖尿病性心肌病病因可能與心肌細(xì)胞代謝紊亂、心肌細(xì)胞鈣運(yùn)轉(zhuǎn)缺陷、冠狀動(dòng)脈微血管病變、心臟自主神經(jīng)損傷、心肌間質(zhì)纖維化等有關(guān)[3]。該類(lèi)疾病患者主要存在心律失常、心肌梗死面積增加、細(xì)胞能量代謝障礙、線粒體損傷以及細(xì)胞凋亡增加等情況。MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要參照物，而氧化應(yīng)激反應(yīng)主要通過(guò)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化而生成脂質(zhì)過(guò)氧化，并破壞酶及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，損傷患者染色體及核酸，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、組織損傷[4]。SOD則是氧自由基清除劑的一種，心肌出現(xiàn)缺血性損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的氧自由基將消耗SOD，故糖尿病性心肌病組大鼠SOD表達(dá)水平降低[5]。CK是動(dòng)物心臟、腦等組織內(nèi)存在的一種承擔(dān)著細(xì)胞內(nèi)能力運(yùn)作、肌肉收縮以及ATP再生的重要物質(zhì)，CK高表達(dá)提示患者可能伴不同程度的肌肉萎縮、心肌梗死癥狀[6]。 LDH是糖酵解酶的一種，多存在于動(dòng)物組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，是臨床常用心肌疾病診斷參照物之一，高表達(dá)的LDH提示患者可能伴急性心肌梗死、地中海貧血、惡性貧血等癥狀。TGF-β1mRNA具有抑制細(xì)胞凋亡的效用，其作用機(jī)制可能與TGF-β1mRNA調(diào)控靶向基因PTEN及MAPK磷酸化水平有關(guān)[7]。miR-21是一種具有調(diào)控功能的小分子RNA，對(duì)生物細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、死亡具有重要作用，是臨床常用的腫瘤及其他相關(guān)疾病診斷參照物。

表1 各組血清及心肌檢測(cè)指標(biāo)比較

注：①與對(duì)照組比較,P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表2 各組心功能測(cè)定指標(biāo)比較

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

曲美他嗪是臨床常用治療心絞痛藥物，其可抑制線粒體長(zhǎng)鏈3-酮脂酰輔酶 A 硫解酶生成，進(jìn)而抑制脂肪酸β-氧化供能途徑，優(yōu)勢(shì)心肌能力代謝方式過(guò)度為葡萄糖氧化，增強(qiáng)心肌能量供應(yīng)效率；可改善人體左心室結(jié)構(gòu)功能，激活冬眠細(xì)胞及頓抑細(xì)胞，最終增強(qiáng)心臟收縮能力；還可抑制自由基合成，維持線粒體功能，降低心肌對(duì)氧的需求，提高氧的利用率，產(chǎn)生大量的高能磷酸鍵，緩解患者心肌缺血癥狀，改善心肌氧供平衡[8]；還可減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Na+含量，提高乳酸利用率，抑制酮體生成，降低細(xì)胞缺氧性酸中毒發(fā)病率[9]。

本研究結(jié)果顯示，模型組CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平均顯著高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)各組，SOD、miR-21水平顯著低于實(shí)驗(yàn)各組和對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組CK、LDH、TGF-β1、MDA、TGF-β1mRNA水平隨著曲美他嗪劑量的增加而逐步下降，SOD、miR-21水平則顯著升高，實(shí)驗(yàn)C組的CK、LDH、TGF-β1、 MDA、SOD、TGF-β1mRNA、miR-21水平與對(duì)照組最接近，但CK、LDH、MDA、TGF-β1mRNA仍高于對(duì)照組。模型組的FS、LVEF、IRVT、E/A均顯著低于實(shí)驗(yàn)各組和對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)各組的E/A、FS、LVEF、IRVT低于對(duì)照組,且隨著曲美他用量的增加上述各指標(biāo)逐步接近對(duì)照組。提示曲美他嗪可改善糖尿病性心肌病大鼠心功能，其機(jī)制可能為曲美他嗪通過(guò)激活內(nèi)源性或外源性TGF-β1mRNA信號(hào)受體，進(jìn)而激活下游凋亡通路，包括依賴(lài)或不依賴(lài)caspase的凋亡途徑，最終對(duì)抑制或促進(jìn)凋亡的基因進(jìn)行修飾，最終實(shí)現(xiàn)改善心肌細(xì)胞損傷的效果[10]。

綜上所述，曲美他嗪可以通過(guò)調(diào)控MAPK-microRNA通路改善心肌酶、心功能等指標(biāo)，平衡心肌氧供，改善糖尿病性心肌病大鼠癥狀。

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Study on the protective effect of trimetazidine on myocardial injury in the rats with diabetic cardiomyopathy

LIANG Junwen,GUO Zhiqiang,LIN Jiamin,DENG Qihuan,HE Wenfei

(The Second People's Hospital of Nanhai District,Foshan 528251,Guangdong,China)

Objective It is to investigate the mechanism of the protective effect of trimetazidine on myocardial injury in the rats with diabetic cardiomyopathy.Methods 60 healthy male Wistar rats were selected and randomly divided into control group,model group,the experimental group A,experimental group B,experimental group C,each group had 12 rats.The control group was fed with standard pelleted diet,model group and every experimental group with high sugar and fat feed,all the rats were given streptozotocin(FTZ 30 mg/kg) by intraperitoneal injection on the sixth week,72 h after injection,the rats whose blood glucose levels were higher than that of 11.1 mmol/L for two times were selected and continue to feed with the original diet for 6 weeks,at the same time the experimental group A,B,C were treated with trimetazidine of 10,30 and 90 mg/(kg·d) by intraperitoneal injection for 6 weeks.In 12 h after the last therapy,heart function,myocardial enzyme spectrum,TGF-β1protein and the expression of mRNA of TGF-β1of the rats in the five groups were observed and compared.Results The levels of CK,LDH,TGF-β1,MDA,TGF-β1mRNA in model group were significantly higher while the levels of SOD and miR-21 were lower than that of control group and experiment groups (P<0.05).The levels of CK,LDH,TGF-β1,MDA,TGF-β1mRNA gradually decreased while the levels of SOD and miR-21 increased with the increasing of trimetazidine dose.The levels of CK,LDH,TGF-β1,MDA,SOD,TGF-β1mRNA,miR-21 in group C were most closely to the control group,but the levels of LDH,MDA,TGF-β1mRNA were still higher than that of control group (P<0.05).FS,LVEF,IRVT,E/A in model group were significantly lower than that of control group and experiment groups (P<005),FS,LVEF,IRVT,E/A in experiment groups were significantly lower than that of control group(P<005),and with the increase of trimetazidine dose these indices gradually close to the control group.Conclusion Trimetazidine can improve cardiac function and myocardiac enzymes,protect myocardium,reduce ventricular remodeling,through regulation of MAPK-microRNA pathway,the effects were more significant with the increase of dosage.

trimetazidine; diabetic cardiomyopathy; myocardial injury

梁俊文，女，主治醫(yī)師，從事內(nèi)科疾病診治工作。

佛山市醫(yī)學(xué)類(lèi)科技攻關(guān)項(xiàng)目(201308187)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.13.004

R-332

A

1008-8849(2015)13-1378-03

2014-10-23