GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌中的表達及臨床意義

楊學麗，路三軍，魏 娉，桂紅武，安 欣，姜琳娜，尹 峰

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌中的表達及臨床意義

楊學麗，路三軍，魏 娉，桂紅武，安 欣，姜琳娜，尹 峰

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

目的 探討GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌中的表達情況及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學S-P方法分別檢測79例患者近端胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織的GSK-3β、DKK-1、β-catenin表達情況，并分析其臨床意義。結果 GSK-3β在近端胃癌組織的表達比癌旁組織及正常胃黏膜組織表達量明顯降低(P均<0.05)，GSK-3β陽性表達率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤程度、淋巴結轉移顯著相關(P均<0.05)。DKK-1在近端胃癌的表達比癌旁組織及正常胃黏膜的表達量均明顯升高(P均<0.05)，DKK-1 陽性表達率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤程度顯著相關(P均<0.05)。β-catenin在近端胃癌中細胞質及細胞核的異常表達比癌旁組織及正常胃黏膜的異常表達均明顯升高(P均<0.05)。GSK-3β的表達與DKK-1的表達及β-catenin的異常表達呈負相關(P均<0.05)。結論 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌的發(fā)展、侵襲和轉移中起重要作用，可作為近端胃癌診斷和判斷預后的指標。

近端胃癌;GSK-3β;DKK-1;β-catenin

胃癌(gastric carcinoma，GC)是我國乃至世界最常見的惡性腫瘤之一，因其侵襲性強和易于轉移而位居癌癥致死原因的前列[1]。近年來研究表明，近端胃癌與其他部位胃癌無論是發(fā)病人群、手術方式、預后等均有不同，已知幽門螺桿菌誘導性胃炎所致的胃酸下降可導致遠端胃癌的發(fā)生[2]，而近端胃癌發(fā)病機制尚不明確。DKK-1(Dickkopf-1)、糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、β-catenin均是參與Wnt 腫瘤信號通路的重要成分，本研究擬采用免疫組織化學方法測定三者在不同部位胃癌組織中的表達情況，并結合臨床病理因素，分析它們在近端胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 研究資料

1.1 材料

1.1.1 標本來源 取自邯鄲市第一醫(yī)院病理科2013—2014年提供的近端胃癌標本79例，同時收集胃癌組織、癌旁組織(距腫物2 cm) 和正常胃黏膜組織(距腫物5 cm以上)，經10%福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、切片并經2名資深病理科醫(yī)生確診?；颊邊⒄誛HO 推薦的分級分化標準，高分化腺癌9例，中分化鱗癌59例，低分化腺癌11例。其中男62例，女17例；年齡18～85(56.4±5.3歲)。每例均有詳細的臨床資料，術前均未進行化療及放療。所有患者的標本采集符合倫理學規(guī)定并得到認可，且患者簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 兔抗人GSK-3β( BS1402) 多克隆抗體購自美國Bioworld Technology 公司，兔抗人DKK-1 多克隆抗體購自美國Santa Cruz 生物技術公司，兔抗人β-catenin 多克隆抗體、S-P免疫組織化學試劑盒及DAB 顯色劑均購自福州邁新生物技術公司，光學顯微鏡和Olympus DP70 圖像采集系統(tǒng)來自日本Olympus 公司。

1.2 實驗步驟 取近端胃癌組織的石蠟包埋標本，制成4 μm 厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，微波修復抗原，3%過氧化氫溶液以阻斷內源性過氧化物酶活性。正常山羊血清封閉，分別滴加一抗為兔抗人GSK-3β( BS1402) 多克隆抗體、兔抗人DKK-1 多克隆抗體(1∶100)和兔抗人β-catenin多克隆抗體(1∶100)，37 ℃孵育2～3 h后依次滴加山羊抗兔二抗，辣根酶標記鏈霉卵蛋白素。DAB 顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封固。以上實驗以PBS 代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 結果判定標準 依據染色細胞比例和染色強度進行綜合評分。在高倍光鏡下(×200) 挑選5 個視野，每個視野計數200個細胞。①GSK-3β 陽性信號主要定位在細胞質，染色分級標準為不表達或<30%細胞表達為0分，陽性細胞數30%～50%為1分，陽性細胞數51%～70%為2分，陽性細胞數>70%為3分。0～1分視為陰性，2～3分為陽性。②DKK-1主要在細胞質與細胞核表達，根據染色程度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將細胞染色程度計分與陽性百分數計分相加即為綜合評分，積分為0～2分表示陰性(-)，3～4分為陽性(+)，5～6分為強陽性()，后兩者均視為陽性表達。③β-catenin染色分級標準為細胞膜表達減少或基本消失為0分，細胞質或細胞核表達為1分，異質性表達減弱為2分，保留細胞膜的表達為3分。0～2分為異常表達，3分為正常表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。樣本率的比較采用卡方檢驗，并將3個不同指標行Speraman相關分析，α=0.05作為統(tǒng)計學檢驗顯著性水準，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達情況 在近端胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜組織中均有GSK-3β、DKK-1、β-catenin的表達。GSK-3β主要位于細胞質(見圖1)，近端胃癌組織比癌旁組織及正常胃黏膜組織表達量均明顯降低(P均<0.05)；DKK-1在近端胃癌、癌旁組織和正常胃黏膜中均有表達，主要位于細胞質(見圖2)，近端胃癌比癌旁組織及正常胃黏膜的表達量均明顯升高(P均<0.05)。β-catenin在近端胃癌、癌旁組織和正常胃黏膜中均有細胞質及細胞核的異常表達(見圖3)，近端胃癌比癌旁組織及正常胃黏膜的異常表達均明顯升高(P均<0.05)。各指標具體表達情況見表1。

圖1 GSK-3β在近端胃癌組織中的表達(SP法，×400)

圖2 DKK-1在近端胃癌組織中的表達(SP法，×400)

圖3 β-catenin在近端胃癌組織中的異常表達(SP法，×400)

表1 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的陽性表達 例(%)

2.2 GSK-3β、DKK-1與近端胃癌組織臨床病理特征的關系 GSK-3β陽性表達率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤程度、淋巴結轉移顯著相關(P均<0.05)，與性別、年齡無明顯相關性(P均>0.05)；DKK-1 陽性表達率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤程度顯著相關(P均<0.05)，與性別、年齡、淋巴結轉移無明顯相關性(P均>0.05)。見表2。

表2 GSK-3β、DKK-1達與近端胃癌組織臨床病理特征的關系 例

2.3 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌組織中表達的相關性 在79例近端胃癌中，GSK-3β與DKK-1的陽性表達與β-catenin的異常表達呈顯著負相關(r=-0.545，P<0.05)。

3 討 論

在當今的醫(yī)療檢查設備條件下, 近端胃癌被發(fā)現時通常正處于進展期，而且由于解剖部位的特殊性，近端胃癌患者的腫瘤還時常浸潤組織,造成淋巴結轉移，導致近端胃癌患者治療困難，預后差。WHO把其歸類于食管胃交界腺癌，指腫瘤完全位于食管胃交界下方，未侵及食管。

分子生物學研究發(fā)現，Wnt/β-catenin信號傳導通路在細胞增殖、分化以及遷移等方面起著重要的調控作用，β-catenin與GSK-3β是Wnt經典信號通路的2個重要調節(jié)因子[3]。GSK-3β是這一信號轉導途徑中重要的調節(jié)分子，它與APC和Axin 形成復合體，使β-catenin N 端絲氨酸/蘇氨酸磷酸化引起β-catenin 降解，從而調節(jié)β-catenin的細胞內含量、定位和功能[4]。本研究結果顯示，GSK-3β在近端胃癌組織中的表達比癌旁組織及正常胃黏膜組織表達量明顯降低，并與β-catenin的異常表達呈顯著負相關，表明GSK-3β的低表達可能促進近端胃癌細胞的增殖，與其發(fā)生密切相關。同時，GSK-3β陽性表達率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤程度、淋巴結轉移顯著相關，提示GSK-3β與腫瘤的侵襲和轉移相關，與文獻[5]報道一致。

DKK-1 是一種分泌型糖蛋白，屬于DKK家族成員，是一種有力的Wnt信號途徑拮抗劑。DKK-1 通過誘導形成一種三元復合物產生內吞作用，發(fā)揮抑制功能，造成Wnt 經典信號傳導途徑阻斷，從而誘導體內多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡[6-7]。本研究結果顯示，DKK-1在近端胃癌中的表達比癌旁組織及正常胃黏膜的表達量明顯升高，與本研究組前期研究結果一致[8]；同時研究顯示，DKK-1 陽性表達率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤程度顯著相關。多種腫瘤中Wnt/β-catenin 信號通路被抑制是由于APC 或者β-catenin 改變而引起DKK-1 在人類細胞中的表達[9]，由此構成了一個負反饋回路，這可能是胃癌中DKK-1 表達增加的原因。Lee等[10]對胃癌患者組織及血清DKK-1表達進行研究發(fā)現，胃癌組血清DKK-1濃度明顯高于健康對照組，腫瘤組織中DKK-1高表達與血清DKK-1高濃度具有相關性，本研究結果與其一致。然而有研究認為胃癌組織中DKK-1的表達下調[11]。故DKK-1在胃癌組織中的表達與胃癌發(fā)生的部位是否具有相關性尚需要進一步研究。

本研究結果顯示，在正常胃組織和癌旁組織中，β-catenin均呈膜表達，而在近端胃癌組織中β-catenin呈胞漿及胞核表達，并與DKK-1的表達呈正相關，與GSK-3β的表達呈負相關，提示三者在近端胃癌的發(fā)展、侵襲和轉移中起重要作用，可作為近端胃癌的診斷和判斷預后的指標。然而腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段改變的復雜過程，該途徑中多種因子變化的機制尚不完全明確，還需要進一步研究。

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Expression of GSK-3β, DKK-1 and β-catenin in proximal gastric cancer and their clinical significance

YANG Xueli, LU Sanjun, WEI Ping, GUI Hongwu, AN Xin, JIANG Linna, YIN Feng

(The First Hospital of Handan City, Handan 056002, Hebei, China)

Objective It is to investigate the expression of GSK-3β, DKK-1 and β-catenin in proximal gastric cancer and their clinical significance. Methods The expression of GSK-3β, DKK-1 and β-catenin were detected in pathological tissue sections of proximal gastric cancer tissues, para-neoplastic tissues and normal gastric mucosa from 79 patients with gtastric cancer by immunohistochemical SP method. Their clinical pathological features were analyzed statistically. Results The expression of GSK-3β in the proximal gastric cancer were significantly lower than that in the para-neoplastic tissues and the normal gastric mucosa (allP<0.05). The positive expression rates of GSK-3β were related with tissue differentiation, TNM clinical stage, myometrial invasion and lymph node metastasis (allP<0.05). The expression of DKK-1 in the proximal gastric cancer were significantly higher than that in the para-neoplastic tissues and the normal gastric mucosa (allP<0.05). The positive expression rates of DKK-1 were related with tissue differentiation, TNM clinical stage, myometrial invasion (allP<0.05). The abnormal expression of β-catenin in the para-carcinoma tissues were significantly higher than that in the para-neoplastic tissues and the normal gastric mucosa (allP<0.05). The expression of GSK-3β has significantly negative correlation with the expression of DKK-1 and the abnormal expression of β-catenin (allP<0.05). Conclusion GSK-3β, DKK-1 and β-catenin play an important role in the development, invasion and metastasis of proximal gastric cancer. They can be used as an index of diagnosis and prognosis of proximal gastric cancer.

proximal gastric cancer; GSK-3β; dickkopf-1; β-catenin

楊學麗，女，碩士研究生，主治醫(yī)師，從事胃腸道疾病病理診斷工作。

路三軍，E-mail:lusanjun211@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.24.008

R735.2

A

1008-8849(2015)24-2646-04

2015-02-10