MIF在兔心肌缺血/再灌注及急性心肌梗死中的動(dòng)態(tài)變化

張存，季祥武

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MIF在兔心肌缺血/再灌注及急性心肌梗死中的動(dòng)態(tài)變化

張存，季祥武

目的探究巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）在兔心肌缺血/再灌注及急性心肌梗死模型中的動(dòng)態(tài)變化。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性新西蘭大白兔18只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、心肌梗死組及再灌注組，每組各6只。以“二線二結(jié)法”構(gòu)造再灌注及心梗模型，假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。心肌梗死組一直結(jié)扎左前降支；再灌注組均給以結(jié)扎30 min再灌注60 min處理。分別在術(shù)前1h、術(shù)后3 h、6 h、24 h、48 h、72 h股靜脈穿刺抽血，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿MIF濃度。結(jié)果三組術(shù)前MIF濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。與假手術(shù)組比較，再灌注組以及心肌梗死組術(shù)后3 h、6 h、24 h、48 h、72 h MIF濃度均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論急性心肌梗死及缺血/再灌注過程中，MIF釋放增加，濃度升高。

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子；心肌再灌注損傷；急性心肌梗死；心肌標(biāo)志物；兔

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）為炎性細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤、糖尿病、缺血-再灌注損傷和心肌梗死等疾病中發(fā)揮重要作用。MIF由115個(gè)氨基酸組成，形成一個(gè)同源三聚體，每個(gè)單體由2個(gè)反向平行的α螺旋和6個(gè)β片層組成，3個(gè)β片層由6個(gè)α螺旋圍繞成一端開放的中空桶樣隧道形狀，能結(jié)合小分子配體，如谷胱甘肽、多巴色素、神經(jīng)節(jié)苷脂等[1]。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等均表達(dá)MIF[2]。冠狀動(dòng)脈斑塊不穩(wěn)定和破裂是急性冠脈綜合癥（acute coronary syndrome，ACS）發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟。MIF參與動(dòng)脈粥樣斑塊形成、發(fā)展及破裂。目前研究發(fā)現(xiàn)MIF能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞向動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)聚集，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，促進(jìn)病變巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），尤其是MMP-2和MMP-9，增加細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白的降解，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的發(fā)生[3]。另外，最新研究[4]發(fā)現(xiàn)其在缺血再灌注過程中發(fā)揮心肌保護(hù)功能。因此，MIF潛在的生物學(xué)功能為冠心病的診斷治療提供新的思路。本實(shí)驗(yàn)旨在研究兔再灌注心梗模型的制備和在再灌注及心梗時(shí)血漿MIF含量的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器兔巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子ELISA試劑盒（上海橋杜生物科技有限公司）、心電圖儀、高速離心機(jī)（Heraeus-SORVALL）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Tek power ware）、超低溫冰箱（Thermo-991）、碘爾康消毒液、肝素鈉及檸檬酸鈉溶液、微量移液器、3%戊巴比妥鈉溶液。

1.2 動(dòng)物模型的建立及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性新西蘭大白兔（濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）共18只，月齡4～6月，體重2.0～3.5 Kg，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、心肌梗死組及再灌注組，每組各6只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)麻醉固定后，均采用“二線二結(jié)法”構(gòu)建急性心肌梗死及再灌注模型[5]，結(jié)扎部位以肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處的左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，于左心耳下方2 mm處穿線結(jié)扎左前降支。各組均以心電圖記錄Ⅱ?qū)?lián)形態(tài)（圖1）。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。心肌梗死組一直結(jié)扎左前降支，以心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段上抬＞0.1 mV，結(jié)扎線以下心肌顏色變暗為結(jié)扎成功標(biāo)志；再灌注組均給以結(jié)扎30 min再灌注60 min處理，心電圖出現(xiàn)抬高的ST段回落＞0.2 mV，或是T波振幅降低或倒置，提示再灌注成功。剖面撒少量青霉素粉，逐層縫合肌肉和皮膚。各組均于術(shù)前1 h，術(shù)后3 h、6 h、24 h、48 h、72 h于股靜脈處采血2 ml，置于EP管中，并以檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合后靜置10～20 min后，以1000×g離心15 min，收集上清液，-70℃凍存，成批測量相關(guān)指標(biāo)。

圖1 Ⅱ?qū)?lián)心電圖（A術(shù)前；B 結(jié)扎10 min后；C再灌注1h）

1.3 血漿MIF含量檢測按照順序添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μl，空白對照孔加入50μl蒸餾水，其余微孔中加入樣品40μl，然后再加生物素標(biāo)記的MIF抗體10μl。封板膜封板后置37℃溫育30 min。揭掉封板膜，棄去液體，洗滌5次。標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本各孔中加入50μl酶標(biāo)溶液（空白對照孔除外），37℃恒溫孵育1h。清洗酶標(biāo)板5次后各孔加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，混勻，25～37℃避光反應(yīng)10～15 min，加入50μl終止液。在450 nm波長讀取各孔OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組術(shù)前MIF濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。與假手術(shù)組比較，再灌注組及心肌梗死組術(shù)后3 h、6 h、24 h、48 h、72 h MIF濃度均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表1）。

表1 各組血漿MIF濃度動(dòng)態(tài)變化

3 討論

MIF是1966年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)可溶性細(xì)胞因子，其基因片段小于1kb，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，外顯子長度為66、107、172個(gè)堿基，內(nèi)含子為94個(gè)和188個(gè)堿基，共有115個(gè)氨基酸殘基，在哺乳動(dòng)物中的同源性達(dá)90%以上。MIF來源廣泛，主要由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生。其不僅參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬和粘附功能，而且可促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）、過氧化氫（H2O2）等，參與體內(nèi)急慢性炎癥反應(yīng)和抗腫瘤等過程。MIF還可以通過蛋白多糖CD44和SRCK（Src家族激酶）與CD74形成信號復(fù)合物從而激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括絲裂原活化蛋白激酶誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，TLR4受體的表達(dá)（Toll樣受體），PI3K/Akt和ERK促細(xì)胞增殖，以及下調(diào)p53抑制細(xì)胞凋亡[6]。近年來發(fā)現(xiàn)它在動(dòng)脈粥樣硬化、缺血-再灌注損傷和心肌梗死等方面也起到重要作用。

炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化形成的主要因素之一[7-9]。MIF為一種炎癥趨化因子，參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[10]。MIF在病變區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，提示MIF在不穩(wěn)定斑塊中的作用[11]。在動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)域，MIF和CSN5/JAB1（NF-κB重要的轉(zhuǎn)錄因子）之間的相互作用參與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥和免疫過程[12]。MIF為CSN5的抑制因子，可能與JAB1協(xié)同調(diào)控NF-κB因子，調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化中的炎癥和免疫信號通路[13]。

本實(shí)驗(yàn)中，無論是再灌注組還是心肌梗死組，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后均出現(xiàn)血漿MIF濃度增高，分析其原因?yàn)椋海?）MIF為組成性表達(dá)，以蛋白前體的形式儲(chǔ)存于心肌細(xì)胞中。當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生缺血、壞死時(shí)，儲(chǔ)存在內(nèi)部的MIF蛋白被釋放進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致血漿MIF濃度的增高。（2）心肌細(xì)胞缺血、壞死，從而引發(fā)劇烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致各種炎癥介質(zhì)的釋放以及炎癥細(xì)胞的浸潤，炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等都是MIF的來源。

若發(fā)生長時(shí)間的缺血，MIF不僅會(huì)失去保護(hù)心肌的作用，反而會(huì)因其廣泛的促炎作用，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)如IL-1、TNF-α等的釋放，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞大量聚集于梗死部位，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[14]。另外，MIF還可通過抑制糖皮質(zhì)激素的抗炎作用，加劇炎癥反應(yīng)。MIF自急性心肌梗死3 h后開始增加，6 h后顯著升高。更重要的是，早期MIF釋放的水平，可能在預(yù)測梗死面積及預(yù)后方面發(fā)揮重要作用，將有望成為一種潛在的心肌標(biāo)志物[15]。

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Dynamic changes of macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischemia/reperfusion and acute myocardial infarction in rabbits

ZHANG Cun*, JI Xiang-wu.*Graduate Department, Weifang Medical College, Weifang 261000, China.

JI Xiang-wu, E-mail: jxwwf@126.com

ObjectiveTo study the dynamic changes of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in myocardial ischemia/reperfusion and acute myocardial infarction (AMI) in rabbits.MethodsMale New Zealand rabbits (n=18) were randomly divided into sham-operation group, AMI group and reperfusion group (each n=6). The models of reperfusion and AMI were established by using 2-suture 2-ligation method, sham-operation group was not given ligation, AMI group was given ligation of left anterior descending branch, and reperfusion group was given ligation for 30 min and reperfusion for 60 min. The blood samples were collected from femoral vein at different time points including 1 h before operation and 3 h, 6 h, 24 h, 48 h and 72 h after operation for detecting plasma MIF concentration by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe plasma MIF concentration had no statistical difference among 3 groups before operation (all P＞0.05), and increased in reperfusion group and AMI group 3 h, 6 h, 24 h, 48 h and 72 h after operation compared with sham-operation group (all P＜0.05).ConclusionMIF will release more and its concentration will increase during the process of AMI and ischemia/reperfusion.

Macrophage migration inhibitory factor; Myocardial reperfusion injury; Acute myocardial infarction; Myocardial markers; Rabbits

R541.4

A

1674-4055(2015)03-0320-03

2014-11-20）

（責(zé)任編輯：姚雪莉）

261000 濰坊,濰坊醫(yī)學(xué)院研究生部(張存);濰坊市人民醫(yī)院心內(nèi)一科(季祥武)

季祥武,E-mail:jxwwf@126.com

10.3969/j.1674-4055.2015.03.09