Toll樣受體1基因多態(tài)性與胃癌癌前病變的相關性研究

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Toll樣受體1基因多態(tài)性與胃癌癌前病變的相關性研究

李靜1王曉燕2崔艷欣1姜相君1*

青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院消化內二科1(266000)國際門診2

背景：大量研究表明，腸化生、異型增生為胃癌的癌前病變。Toll樣受體1(TLR1)基因多態(tài)性與多種疾病的發(fā)生相關，但與胃癌癌前病變關系的研究少見。目的：探討TLR1基因rs4833095位點多態(tài)性與胃癌癌前病變的相關性。方法：選取2008年12月—2014年12月青島市市立醫(yī)院432例胃癌癌前病變患者(包括上皮內瘤變84例、腸化生348例)，同時以540名健康志愿者作為對照。采用DNA測序法檢測TLR1基因rs4833095位點基因型，評估幽門螺桿菌(Hp)感染狀態(tài)。以多因素Logistic回歸模型分析TLR1基因多態(tài)性與胃癌癌前病變的關系。結果：病例組TLR1基因rs4833095位點GG、GA、AA基因型頻率與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.966，P=0.000)，病例組AA基因型頻率明顯高于對照組(17.6%對8.9%；χ2=16.336，P=0.000)。多因素Logistic回歸分析顯示，與GG基因型相比，攜帶AA基因型者胃癌癌前病變的發(fā)病風險明顯增加(OR=1.329，95%CI：1.002~1.762)。與GG+GA基因型且未感染Hp的患者相比，攜帶AA基因型并感染Hp者發(fā)生胃癌癌前病變的風險明顯增加(OR=3.617，95%CI：2.147~6.092)。結論：TLR1 rs4833095基因多態(tài)性與胃癌癌前病變發(fā)病風險呈正相關。

關鍵詞Toll樣受體1；基因多態(tài)性；胃腫瘤；癌前狀態(tài)

腸化生、異型增生為胃癌的癌前病變，其病因、發(fā)病機制尚不明確，目前已知幽門螺桿菌(Hp)感染和個體遺傳因素等在其中起重要作用[1-3]。Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子，亦是連接非特異性免疫與特異性免疫的橋梁。研究發(fā)現，TLR1基因多態(tài)性可能與Hp的發(fā)病風險相關[4]。TLR1基因多態(tài)性還與前列腺癌、兒童IgA腎病、子宮內膜炎、妊娠期瘧疾等疾病的發(fā)病風險相關[5-8]。但目前關于TLR1基因多態(tài)性與胃癌癌前病變關系的研究少見。本研究通過直接測序法檢測TLR1 rs4388095位點基因型，旨在探討其多態(tài)性與胃癌癌前病變的關系，從而為闡明胃癌癌前病變的遺傳機制提供依據。

對象與方法

一、研究對象

收集2008年12月—2014年12月青島市市立醫(yī)院消化科就診的胃癌癌前病變患者432例，均經胃鏡和組織病理學確診。其中男196例，女236例；年齡26~50歲，平均41歲；上皮內瘤變84例，腸化生348例。取同期行胃鏡和組織病理學檢查正常者540名作為對照組，其中男272名，女268名；年齡18~50歲，平均38歲。

兩組受試者均為無血緣關系的山東省漢族人，檢查前2周未服用過抗菌藥物、鉍劑、質子泵抑制劑、非甾體消炎藥。兩組受試者的性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，病例組吸煙狀況(33.3%對27.2%；χ2=4.273，P=0.039)、Hp感染率(50.0% 對32.6%；χ2=30.220，P=0.000)顯著高于對照組。本研究方案經青島大學臨床學院倫理委員會批準，研究對象均取得知情同意。

二、方法

1. DNA提?。喝?0 mg胃竇組織，用基因組DNA提取試劑盒[離心柱型，天根生化科技(北京)有限公司]提取受檢者DNA，Bioteke超微量紫外可見分光光度計(ND5000)檢測DNA濃度，并將其稀釋至5 ng/μL。

2. 基因型分析：PCR引物序列見參考Hamann等[8]的研究，由上海英濰捷基公司合成。PCR反應體系總體積20 μL，含10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物技術有限公司)10 μL，DNA模板2 μL，去離子水7 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 終末循環(huán)10 min。取4 μL PCR產物，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。由上海英濰捷基公司采用ABI 3730測序儀對PCR產物進行測序。測序結果分析：采用Chroms 1.62軟件讀取測序峰圖，GA基因型可見GA雙峰，GG或AA基因型表現為單一的G或A峰。讀取結果后，用DNAMAN 6.0軟件進行分析。

3. Hp感染狀態(tài)檢測：根據《第四次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》[9]，采用胃黏膜組織快速尿素酶試驗(試劑盒購自杭州依靈生物工程有限公司)判定Hp感染。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計算各組基因型頻率。采用χ2檢驗行Hardy-Weinberg平衡遺傳檢驗。采用Pearsonχ2檢驗比較性別、年齡(按年齡中位數分組)、Hp感染和吸煙狀況以及各基因型在病例組與對照組中的差異。以非條件Logistic回歸模型調整混雜因素，分析基因型與胃癌癌前病變的關系以及基因多態(tài)性與Hp感染的交互作用，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、基因型鑒別

PCR擴增后所得的目的片段長度為347 bp，測序后得到3種基因型，即GG純合型、GA雜合型和AA純合型(圖1)?？傮w、病例組和對照組TLR1 rs4833095基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性(表1)。

A：GG型；B：GA型；C：AA型

基因型總體(n=972)病例組(n=432)對照組(n=540)GG396(40.7)180(41.7)216(40.0)GA452(46.5)176(40.7)276(51.1)AA124(12.8)76(17.6)48(8.9)χ2值0.0393.9094.826P值0.9810.1420.090

二、TLR1 rs4833095 基因多態(tài)性與胃癌癌前病變的相關性

病例組TLR1 rs4833095 基因型分布與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.966，P=0.000)，進一步分析發(fā)現病例組AA基因型頻率明顯高于對照組(17.6%對8.9%；χ2=16.336，P=0.000)。與攜帶GG基因型者相比，攜帶AA基因型者胃癌癌前病變的發(fā)病風險明顯增加(OR=1.329，95%CI：1.002~1.762)，而攜帶GA基因型者胃癌癌前病變的發(fā)病風險無明顯增加(OR=0.812，95%CI：0.523~1.260)。

三、各基因型分布與Hp感染的相關性

Hp陽性組AA基因型頻率為18.4%(72/392)，明顯高于Hp陰性組的9.0%(52/580)，組間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=37.156，P=0.000)；而Hp陽性組GA+GG基因型頻率為81.6%(320/392)，Hp陰性組為91.0%(528/580)，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

以Hp陰性且攜帶GG+GA基因型者為參照，單獨攜帶AA基因型(OR=2.110，95%CI：1.189~3.744)或單獨感染Hp(OR=1.999，95%CI：1.507~2.625)者胃癌癌前病變的發(fā)病風險增加，而Hp感染陽性且攜帶AA基因型者胃癌發(fā)病風險進一步增加(OR=3.617，95%CI：2.147~6.092)(表2)。

表2Hp感染與TLR1 rs4833095位點多態(tài)性聯合作用對胃癌癌前病變的影響n(%)

組 別例數Hp陰性GG+GAAAHp陽性GG+GAAA病例組432188(43.5)28(6.5)168(38.9)48(11.1)對照組540340(63.0)24(4.4)152(28.2)24(4.4)

討論

TLR是Ⅰ型跨膜蛋白受體，可識別來源于微生物的具有保守結構的分子，即病原相關分子模式，對天然和獲得性免疫進行調控[10]。當微生物突破物理屏障，如皮膚、黏膜等時，TLR可識別并激活機體產生免疫細胞應答，維持機體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[11]。TLR1作為單體存在時沒有活性，可與TLR2相互作用，形成異二聚體，識別細菌上的抗原，如革蘭陰性菌的脂磷壁酸(LTA)和革蘭陽性菌的肽聚糖，還能識別內源性分子(如熱休克蛋白)以及病毒表面成分等，誘導產生多種細胞因子，參與機體的炎癥和相關免疫反應[12]。

TLR1基因位于染色體4p14，長度約8 537 bp，包含4個外顯子，其中rs4833095位于第4外顯子，突變后編碼的氨基酸由絲氨酸(Ser)變成天冬酰胺(Asn)。本研究發(fā)現，TLR1 rs4833095位點多態(tài)性與胃癌癌前病變風險密切相關，病例組AA基因型頻率明顯高于對照組。王正強等[4]對200例Hp陽性和200例Hp陰性患者TLR1 rs4833095位點基因型與Hp感染的關系進行研究，結果顯示該基因多態(tài)性可影響Hp易感性，AA基因型可能是患者感染Hp的易感因素。Yang等[13]的研究發(fā)現，非功能性TLR1 602S/S基因型可能通過減少Th1細胞反應，降低Hp相關胃病的發(fā)病風險。因此，有必要進一步研究該基因其他潛在功能性多態(tài)性位點，分析各基因多態(tài)性位點的相互關系以及與胃癌癌前病變風險的關系。

TLR1 rs4833095基因AA型導致胃癌癌前病變風險增加的可能機制是由于Ser248Asn氨基酸替換位置緊鄰TLR1配體結合點和二聚體結合位點，使TLR1-TLR2功能改變，無法識別Hp，鈍化宿主對Hp的炎癥反應，以便于Hp的定植[14]。小鼠模型研究證明，TLR2、TLR8、TLR9通過樹突細胞參與Hp的識別，僅TLR2是惟一的細胞表面受體/配體系統(tǒng)，能引發(fā)明顯抗炎應答[15-16]。TLR2、TLR4還與Hp的某些致病機制有關[17-18]。TLR1-TLR2可識別革蘭陰性菌包膜上的三?；摹p脂質A由三?；臉嫵桑@使其成為TLR1-TLR2的理想配體[19]。因此，TLR1為Hp最可能的受體，在識別Hp引發(fā)的炎癥中發(fā)揮重要作用。本研究進一步分析了Hp與該基因多態(tài)性的聯合效應，結果顯示攜帶AA基因型且Hp陽性的胃癌癌前病變發(fā)病風險明顯增高，提示遺傳因素與環(huán)境因素可能存在聯合作用。

總之，本研究顯示TLR1基因rs4833095位點多態(tài)性與胃癌癌前病變的發(fā)病風險密切相關，AA純合子與胃癌癌前病變易感有關，并與Hp感染存在聯合效應，共同影響胃癌癌前病變的發(fā)病風險。但由于樣本量較小，今后應擴大樣本量進一步研究。此外，研究發(fā)現TLR家族其他基因(如TLR2、TLR4和TLR5等)多態(tài)性可能與胃癌癌前病變發(fā)生相關[2，20]。因此，有必要在今后的工作中進一步深入開展中國人群基因多態(tài)性篩選，研究TLR家族其他基因多態(tài)性的分布和頻率，系統(tǒng)評價TLR基因多態(tài)性與胃癌癌前病變的關系。

參考文獻

1 Achyut BR, Ghoshal UC, Moorchung N, et al. Association of Toll-like receptor-4 (AsP299Gly and Thr399Ileu) gene polymorphisms with gastritis and precancerous lesions[J]. Hum Immunol, 2007, 68 (11): 901-907.

2 Fan YF, Wu YM, Liu H, et al. TLR4 polymorphisms associated with developing gastric pre-cancer lesions in a Chinese Han population[J]. Hum Immunol, 2014, 75 (2): 176-181.

3 Hold GL, Rabkin CS, Chow WH, et al. A functional polymorphism of toll-like receptor 4 gene increases risk of gastric carcinoma and its precursors[J]. Gastroenterology, 2007, 132 (3): 905-912.

4 王正強, 于新娟, 王莉莉, 等. Toll受體-1基因多態(tài)性與幽門螺桿菌易感性的關系[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2014, 30 (1): 102-104.

5 Stevens VL, Hsing AW, Talbot JT, et al. Genetic variation in the toll-like receptor gene cluster (TLR10-TLR1-TLR6) and prostate cancer risk[J]. Int J Cancer, 2008, 123 (11): 2644-2650.

6 Lee JS, Park HK, Suh JS, et al. Toll-like receptor 1 gene polymorphisms in childhood IgA nephropathy: a case-control study in the Korean population[J]. Int J Immunogenet, 2011, 38 (2): 133-138.

7 Taylor BD, Darville T, Ferrell RE, et al. Racial variation in toll-like receptor variants among women with pelvic inflammatory disease[J]. J Infect Dis, 2013, 207 (6): 940-946.

8 Hamann L, Bedu-Addo G, Eggehe TA, et al. The toll-like receptor 1 variant S248N influences placental malaria[J]. Infect Genet Evol, 2010, 10 (6): 785-789.

9 劉文忠, 謝勇, 成虹, 等. 第四次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告[J]. 胃腸病學, 2012, 17 (10): 618-625.

10Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity[J]. Nat Immunol, 2001, 2 (8): 675-680.

11Medzhitov R, Preston Hurlburt P, Janeway CA Jr, et al. A human homologue of the drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J]. Nature, 1997, 388 (6640): 394-397.

12Kang SS, Kauls LS, GasPari AA. Toll-like receptors: applications to dermatologic disease[J]. J Am Acad Dermatol, 2006, 54 (6): 951-983.

13Yang CA, Scheibenbogen C, Bauer S, et al. A frequent Toll-like receptor 1 gene polymorphism affects NK- and T-cell IFN-γ production and is associated withHelicobacterpylori-induced gastric disease[J]. Helicobacter, 2013, 18 (1): 13-21.

14Guan Y, Omueti-Ayoade K, Mutha SK, et al. Identification of novel synthetic toll-like receptor 2 agonists by high throughput screening[J]. J Biol Chem, 2010, 285 (31): 23755-23762.

15Rad R, Ballhoru W, Voland P, et al. Extracellular and intracellular pattern recognition receptors cooperate in the recognition ofHelicobacterpylori[J]. Gastroenterology, 2009, 136 (7): 2247-2257.

16Rad R, Brenner L, Krug A, et al. Toll-like receptor-dependent activation of antigen-presenting cells affects adaptive immunity toHelicobacterpylori[J]. Gastroenterology, 2007, 133 (1): 150-163.

17劉翔, 林漫鵬, 呂建忠, 等.TLR2、TLR4、TLR5和TLR9在小鼠HP感染模型中的表達[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2011, 27 (13): 2327-2329.

18劉翔, 丁元偉, 林虹. Toll樣受體4通路在幽門螺桿菌致病機制中的作用[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2012, 28 (19): 3174-3177.

19Suda Y, Ogawa T, Kashihara W, et al. Chemical structure of lipid A fromHelicobacterpyloristrain 206-1 lipopoly-saccharide[J]. J Biochem, 1997, 121 (6): 1129-1133.

20Zeng HM, Pan KF, Zhang Y, et al. Genetic variants of toll-like receptor 2 and 5,helicobacterpyloriinfection, and risk of gastric cancer and its precursors in a chinese population[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2011, 20 (12): 2594-2602.

(2015-05-15收稿；2015-08-01修回)

Relationship of Toll-like Receptor 1 Gene Polymorphism with Gastric Precancerous LesionsLIJing1,WANGXiaoyan2,CUIYanxin1,JIANGXiangjun1.1DepartmentofGastroenterologyⅡ,2InternationalClinic,QingdaoMunicipalHospital,QingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao,ShandongProvince(266000)

Correspondence to: JIANG Xiangjun, Email: drjxj@163.com

Background: Intestinal metaplasia and intraepithelial neoplasia are precancerous lesions of gastric cancer. Toll-like receptor 1 (TLR1) gene polymorphism is related with many diseases, however, only few studies have been performed on its relationship with gastric precancerous lesions. Aims: To investigate the relationship between TLR1 rs4833095 polymorphism and gastric precancerous lesions. Methods: A total of 432 patients with gastric precancerous lesions (including 84 intraepithelial neoplasia, 348 intestinal metaplasia) from Dec. 2008 to Dec. 2014 at Qingdao Municipal Hospital were enrolled, and 540 healthy subjects were served as controls. TLR1 rs4833095 polymorphism was determined by DNA sequencing, andHelicobacterpylori(Hp) infection was detected. Relationship of TLR1 gene polymorphism with gastric precancerous lesions was analyzed by multiple Logistic regression model. Results: Significant differences in the frequencies of GG, GA and AA genotype on TLR1 rs4833095 were found between disease group and control group (χ2=19.966,P=0.000)．The frequency of AA genotype in disease group was significant higher than that in control group (17.6%vs. 8.9%; χ2=16.336,P=0.000). Compared with GG genotype, patients with AA genotype were obviously more susceptible to gastric precancerous lesions (OR=1.329, 95%CI: 1.002-1.762). Compared with GG+GA genotypes with negative Hp, patients with AA genotype and positive Hp infection had much higher susceptibility to gastric precancerous lesions (OR=3.617, 95%CI: 2.147-6.092). Conclusions: TLR1 rs4833095 polymorphism is positively associated with susceptibility to gastric precancerous lesions.

Key wordsToll-Like Receptor 1;Gene Polymorphism;Stomach Neoplasms;Precancerous Conditions

通信作者*本文，Email: drjxj@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.12.006