利用TALEN技術(shù)高效制備TXNIP基因敲除小鼠模型

張歡歡，劉楚新，馬　月，肖麗萍，李飛達，應華忠，劉　歡

(1.浙江省醫(yī)學科學院浙江省實驗動物中心，杭州　310013；2.深圳華大基因研究院，深圳　518083)

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利用TALEN技術(shù)高效制備TXNIP基因敲除小鼠模型

張歡歡1，劉楚新2，馬月1，肖麗萍2，李飛達2，應華忠1，劉歡2

(1.浙江省醫(yī)學科學院浙江省實驗動物中心，杭州310013；2.深圳華大基因研究院，深圳518083)

【摘要】目的利用顯微注射技術(shù)注射敲除Txnip基因的TALEN mRNA獲得TXNIP敲除小鼠。方法在線設計Txnip敲除位點，構(gòu)建TALEN載體并在細胞水平驗證剪切活性，體外轉(zhuǎn)錄TALENs成mRNA并通過顯微注射技術(shù)注射到C57BL/6J小鼠受精卵，對F0代小鼠進行DNA水平鑒定獲得TXNIP敲除小鼠。結(jié)果在Txnip第一外顯子上設計了TALEN識別剪切位點，并在細胞水平驗證具有剪切活性，注射mRNA到受精卵獲得了4只敲除小鼠，其中2只Txnip發(fā)生移碼突變，成功制備了TXNIP敲除小鼠。結(jié)論通過注射TALENs mRNA可以高效制備TXNIP敲除小鼠。

【關(guān)鍵詞】TALEN；顯微注射；TXNIP；基因敲除；模型，小鼠

基因敲除小鼠模型是研究基因功能的重要工具之一，最早科學家利用同源重組技術(shù)制備基因敲除小鼠ES細胞系，然后通過囊胚注射制備基因敲除小鼠[1,2]，近年來興起的基因組編輯工具，例如鋅指核酸酶ZFN[3]，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶TALEN[4]，規(guī)律成簇間隔短回文重復序列CRISPR以及CRISPR相關(guān)蛋白系統(tǒng)CRISPR/Cas系統(tǒng)[5]，都大大提高了基因敲除小鼠制備效率。TALEN (transcription activator-like effector nucleases)通過類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物(TALE)識別DNA序列，并在特定位點對DNA進行切割，形成雙鏈斷裂(DSB)，隨后在非同源末端連接(NHEJ)修復機制下形成隨機的多個堿基的插入或刪除，從而實現(xiàn)基因敲除[6]。

硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(thioredoxin-interacting protein，Txnip)通過與硫氧還原蛋白( thioredoxin，Trx) 結(jié)合抑制其活性，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)氧化還原的作用[7]。TXNIP 不僅通過調(diào)節(jié)NLRP3參與2型糖尿病的發(fā)生[8]，而且是腫瘤抑制相關(guān)基因，與黑色素瘤、肝細胞癌、乳腺癌、白血病等聯(lián)系密切[9]。本研究采用TALEN技術(shù)敲除C57BL/6J小鼠Txnip基因，為進一步研究Txnip的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1TALENS位點設計

根據(jù)NCBI上Txnip基因序列，利用TALEN在線設計工具(http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx)設計基因敲除位點。TALENs敲除靶序列如下：TALEN-L靶向5’-TGTGAAGTTACCCGAGTC-3’，TALEN-R靶向5’-TGGCCACGCCGCAAGCCA-3’。中間的sapcer序列為AAAGCCGTCAGGATCC，其中GGATCC為BamHI酶切位點。

1.2TALENs載體構(gòu)建

采用Golden gate TALEN and TAL Effector kit[10]將識別靶序列的RVD模塊構(gòu)建到pTAL3載體上。然后將TALEN片段通過AflII和XhoI雙酶切構(gòu)建到pcDNA3.1載體上，使得TALEN表達由CMV或者T7啟動子啟動，其中CMV啟動TALENs在動物細胞中表達，T7啟動TALENs體外轉(zhuǎn)錄成mRNA。將測序正確的TALENs表達載體采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA)提取質(zhì)粒備用。

1.3TALENs載體活性驗證

復蘇小鼠Hepa1-2細胞系，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在6孔板上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%37℃，CO2。采用lipofectamine(Invitrogen)將TALEN-F和TALEN-R共轉(zhuǎn)染細胞，并且以EGFP轉(zhuǎn)染作為陰性對照，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后用0.25%胰酶(Life technologies)消化收集細胞，提取DNA。設計活性鑒定引物，引物序列如下：TXNIP-F為5’-TCGGCTCAATCATGGTGATGT-3’，TXNIP-R為5’-TAGGGGGGTGAAGGGTAGTGA-3’。以細胞DNA為模板進行PCR擴增，并采用BamHI進行酶切鑒定，其中擴增片段大小為421 bp，酶切片段為146 bp + 275 bp。

1.4體外轉(zhuǎn)錄

AflII和XhoI雙酶切TALENs無內(nèi)毒素質(zhì)粒，電泳回收片段，并用cycle-purekit(OMEGA)進行純化。以純化片段為模板，采用mMESSAGE mMACHINE T7 Kit(Life Technologies)進行體外轉(zhuǎn)錄合成加帽mRNA，再用Poly(A) Tailing Kit(Life Technologies)對mRNA進行加尾。將轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定mRNA純化回收并用顯微注射緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA，pH 7.4)稀釋到100 ng/μL，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5顯微注射

C57BL/6J品系小鼠由上海市西普爾必凱實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2013-0016；ICR小鼠由浙江省醫(yī)學科學院提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SZXK(浙)2014-0001。實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2014-0008。將Txnip的TALEN-L和TALEN-R mRNA混合在一起后在顯微鏡(Nikon)下利用顯微操作系統(tǒng)(Eppendorf)注射到C57BL/6J的受精卵中，并移植到ICR受體雌鼠，具體實驗方法參考小鼠胚胎操作實驗手冊[11]。

1.6突變檢測及基因型分析

取出生1周齡小鼠鼠尾提取基因組DNA，按照活性鑒定方法對F0代小鼠進行鑒定。并將BamHI酶切鑒定為陽性的小鼠的PCR擴增產(chǎn)物連接到T載體上，進行Sanger測序(Invitrogen)，進行突變基因型分析。

2結(jié)果

2.1 TALEN載體構(gòu)建及活性鑒定

圖1　Txnip基因敲除TALENs位點Fig.1　The TALENs binding site in the mouse Txnip gene

小鼠Txnip基因有兩個已知轉(zhuǎn)錄本，為了高效敲除TXNIP蛋白表達，本研究選擇的敲除位點為Txnip基因的第一外顯子區(qū)域兩個轉(zhuǎn)錄本重疊的部分，如圖1。TAL-effector識別模塊HD、NG、NI、NN分別識別堿基C、T、A、G[12]，因此本研究中識別Txnip的模塊序列分別為5’-NN-NG-NI-NI-NN-NG-NG-NI-HD-HD-HD-NN-NI-NN-NG-HD-3‘和5’-NN-NN-HD-HD-NI-HD-NN-HD-HD-NN-HD-NI-NI-NN-HD-HD-NI-3’。為了便于活性鑒定及后期小鼠陽性鑒定，本研究識別序列中間的spacer含有BamHI酶切位點，如圖1所示。

將構(gòu)建的好的TALENs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠Hepa1-2細胞系，進行活性鑒定。如圖2所示，與陰性對照相比，BamHI酶切后，TxnipTALENs轉(zhuǎn)染的細胞DNA有未切開片段，說明其部分DNA樣品BamHI酶切位點被破壞，進而驗證了本研究采用的TALENs有剪切活性。

圖2　Txnip TALENs剪切活性驗證酶切電泳圖Fig.2　Cleavage activity of TALENs by restriction fragment length polymorphism analysis

2.2 TXNIP基因敲除小鼠構(gòu)建及鑒定

體外轉(zhuǎn)錄分別得到TALEN-L和TALEN-R的mRNA，如圖3。將mRNA分別稀釋到100 ng/μL后等量混合進行胞質(zhì)注射，共注射400枚受精卵，移植383枚到14只ICR受體母鼠，其中8只懷孕，出生26只F0代小鼠。。對出生的26只F0代小鼠進行PCR酶切鑒定，從圖4A可以看出，跟陰性對照(N)相比，11#，20#，22#，26#都有BamHI未切開片段。經(jīng)Sanger測序驗證，11#小鼠屬于嵌合體，有3種基因型，包括WT、缺失21 bp、缺失4 bp，20#、22#、26#小鼠屬于基因單敲除，分別缺失15 bp、10 bp、19 bp(圖4B)。鑒定結(jié)果顯示，26只F0代小鼠有4只敲除陽性小鼠，敲除效率為15.4%，其中22#和26#小鼠Txnip發(fā)生移碼突變，可作為F0代陽性小鼠繼續(xù)繁育獲得TXNIP雙敲除模型。本研究獲得了Txnip基因敲除小鼠founder，可作為基因功能研究工具深入探討Txnip基因的生物學活性。

圖3　Txnip TALENs體外轉(zhuǎn)錄mRNAFig.3　Txnip TALEN mRNAs transcripted in vitro

3討論

相對于傳統(tǒng)打靶同源重組10-6概率，基因組編輯工具大大提升了基因敲除的效率，因而在基因功能研究領(lǐng)域快速推廣。TALEN技術(shù)2012年被Science雜志評為十大科學突破之一，具有操作簡單，特異性高等特點，廣泛應用于動物、植物、微生物等多個物種[13]。通過截短TALE蛋白的N-端和C-端并連接異源FokI(ELD/KKR)實現(xiàn)的TALEN系統(tǒng)優(yōu)化可以有效提高剪切效率并降低脫靶效率[14]， Xin等[15]采用該優(yōu)化系統(tǒng)獲得89.5%的敲除細胞系。本研究實驗結(jié)果顯示Txnip敲除陽性率為15.4%，遠低于該系統(tǒng)在其他基因敲除動物制備的效率[16,17]，可能原因有兩種，第一本研究構(gòu)建的TALEN活性低于其他研究者選擇的TALEN的活性，因而造成顯微注射獲得的陽性受精卵較少；第二Txnip基因本身參與細胞的凋亡[9]，對細胞的生長發(fā)育有一定的影響，造成出生小鼠陽性率較低。

通過胞質(zhì)注射TALEN mRNA的方法制備的基因敲除動物模型，其部分F0代基因型為嵌合體[18]，這跟注射的mRNA量有一定的關(guān)系，當受精卵發(fā)育到二細胞期或者四細胞期時，仍然有表達TALEN的mRNA進行翻譯并對基因組進行剪切，因此發(fā)育的囊胚存在多種基因型[4]。本研究獲得的11# Txnip敲除小鼠表現(xiàn)為3種基因型，屬于嵌合體。多數(shù)嵌合體小鼠繁育的F1代小鼠能夠?qū)⒉煌幕蛐头蛛x出來，并保持穩(wěn)定遺傳。因此TALEN技術(shù)雖然能夠快速制備基因敲除動物模型，獲得純合的敲除模型則需要更長的時間進行繁育和篩選。

A：出生小鼠Txnip基因PCR產(chǎn)物BamHI酶切鑒定電泳結(jié)果；B：酶切鑒定陽性小鼠測序結(jié)果。圖4　Txnip小鼠鑒定結(jié)果A: Genotyping of all newborn mice by gel electrophoresis of BamHI digested PCR products spanning the Txnipgene target site；B: Sanger sequencing of positive founder mice which were identified by BamHI digestion.Fig.4　Identification of TALEN-induced Txnip mutants in the founder mice.

TXNIP(thioredoxin-interacting protein)具有多種生物學功能，尤其在氧化還原平衡中起著重要作用[19]。TXNIP既可以通過ASK1-Trx-TXNIP信號通路調(diào)節(jié)細胞凋亡[20]、抑制DNA轉(zhuǎn)錄[21]，還可以與NLRP3結(jié)合激活炎癥反應[22]，因而TXNIP可能發(fā)揮抑制腫瘤的功能，尤其是在肝癌[23]、乳腺癌[24]、膀胱癌[25]、白血病[26]等癌癥中表達量均顯著下降。本研究通過注射敲除Txnip的TALEN mRNA構(gòu)建的TXNIP敲除小鼠，除了Txnip基因序列發(fā)生改變，沒有引入任何外源片段，相對于傳統(tǒng)方法更加“干凈”。除此之外，TALEN技術(shù)敲除基因表達的原理是識別特異序列并進行剪切形成雙鏈斷裂((double strand break, DSB)，通過非同源末端修復引入序列改變。有報道表明，切割位點越靠近5’端基因表達起始位點，對其形成的蛋白功能影響越大，從而基因敲除的效應越明顯[27]。本研究設計的識別序列在Txnip基因的第一外顯子，而且是兩個轉(zhuǎn)錄本重疊的部分，因而本研究獲得的TXNIP敲除小鼠是研究TXNIP功能的良好模型。

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〔修回日期〕2015-04-20

研究報告

Efficient preparation of a TXNIP knockout mouse model by

transcription activator-like effector nucleases (TALEN)

ZHANG Huan-huan1, LIU Chu-xin2, MA Yue1, XIAO Li-ping2, LI Fei-da2, YING Hua-zhong1, LIU Huan2

(1. Zhejiang Laboratory Animal Center，Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China;

2. BGI-Shenzhen, Shenzhen 518083)

【Abstract】ObjectiveTo knockout the murine Txnip gene using microinjection of transcription activator-like effector nuclease (TALEN) mRNAs. MethodsTALEN knockout site recognizing Txnip was designed by tools on line, then constructed the vectors and assayed its cleavage activity at cellular level. TALEN mRNA was transcribed in vitro and microinjected into C57BL/6J mouse zygotes. F0 mice were verified at DNA level with BamHI and TXNIP-knockout mice were obtained. Results We designed and constructed TALENs which recognized and cut the first exon of Txnip, and got four TXNIP knockout mice, among which two were frameshift mutation, demonstrating that the TXNIP-knockout mice were generated by TALEN technique. ConclusionsMicroinjection of in vitro transcribed TALEN mRNAs into murine zygotes is a highly effective and convenient way to develop TXNIP-knockout mouse model.

【Key words】TALEN; Microinjection; TXNIP; Gene knockout;Model， mouse

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.002

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 06-0009-05

[通訊作者]劉歡(1984-)，男，助理研究員，研究方向：轉(zhuǎn)基因動物開發(fā)。E-mail： liuhuan@genomics.cn。

[作者簡介]張歡歡(1985-)，女，研究實習員，研究方向：動物疾病模型。E-mail： zhanghuanhuan2014@126.com。

[基金項目]浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才項目，浙江省科技廳院所專項(2014F10033)。