PSD-95抑制劑在缺血性腦損傷后的神經(jīng)保護作用

歐陽馥冰陳藝聰曾進勝

·綜 述·

PSD-95抑制劑在缺血性腦損傷后的神經(jīng)保護作用

歐陽馥冰*陳藝聰*曾進勝*

腦缺血 神經(jīng)保護藥 PDZ結(jié)構(gòu)域

迄今絕大多數(shù)在腦缺血動物模型中證實有效的神經(jīng)保護藥物，進入臨床試驗后都被證實無效甚至有害[1]。近年來，突觸后致密物-95（postsynaptic density-95，PSD-95）抑制劑成為神經(jīng)保護治療研究的新熱點。本文對PSD-95抑制劑Tat-NR2B9c（NA-1）從離體細胞、嚙齒類動物、非人靈長類動物到人體試驗的研究進展進行綜述。

1 離體細胞中證實抑制PSD-95可減輕缺血性神經(jīng)元損傷

PSD-95是一種細胞腳手架蛋白，通過其氨基端2個PDZ結(jié)構(gòu)域與N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-as?partate receptor，NMDAR）的NR2亞基羧基端結(jié)合，將NM?DAR錨定在突觸后膜活性區(qū)，并募集細胞質(zhì)的神經(jīng)元一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOs），使其移位到細胞膜上，形成NMDAR/PSD-95/nNOs蛋白三聚體[2]。急性腦缺血時，NMDAR過度激活介導的Ca2+內(nèi)流可激活Ca2+依賴的nNOs，催化生成NO，最終產(chǎn)生大量自由基[3]。

Michelle Aarts等[3]利用NR2B亞基羧基端的9個氨基酸與Tat轉(zhuǎn)導肽融合產(chǎn)生一種PSD-95抑制劑Tat-NR2B9c（NA-1）。體外實驗證實該多肽分子能穿透細胞膜，干擾PSD-95與NMDAR的結(jié)合，減少NO的生成（圖1）。NO和自由基生成的減少，有助于減輕線粒體損傷和ATP消耗，提高細胞存活率[4]。NA-1不影響NMDAR的表達、NMDAR介導的Ca2+內(nèi)流及細胞質(zhì)內(nèi)nNOs的正常功能，可避免直接阻斷NMDAR及抑制nNOs活性造成的不良反應[2-3]。

NA-1還可通過激活鈣調(diào)蛋白激酶IV（calmodulin ki?nase IV，CaM IV）依賴的cAMP反應元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB），促進神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)保護基因的轉(zhuǎn)錄與表達[5]。這提示PSD-95抑制劑可通過影響NMDAR下游的其他信號傳導通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

2 PSD-95抑制劑縮小大鼠腦梗死灶體積并改善神經(jīng)功能

在嚙齒類動物中，NA-1經(jīng)外周靜脈注射后能通過完整的血腦屏障[3]。Michelle Aarts等[3]在短暫性大腦中動脈阻塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）大鼠模型中證實，卒中前45 min、卒中后1 h單次靜脈注射NA-1（7.5 mg/kg），卒中后24 h腦梗死灶體積較對照組明顯減?。s54.6%、67.0%），伴隨神經(jīng)功能的改善。

為進一步探討不同梗死嚴重程度、性別及給藥時間窗對NA-1神經(jīng)保護作用的影響，Sun等[6]進行了一系列相關(guān)實驗。實驗1選用雌、雄大鼠，開顱電凝一側(cè)大腦中動脈3支軟腦膜分支，此法梗死灶較小，程度輕，且不影響卒中后動物的體溫。卒中后1 h單次給藥，24 h后雌、雄大鼠梗死灶體積均較對照組減少約60%，提示NA-1在不同性別的嚙齒類動物中均有神經(jīng)保護作用。實驗2制備永久性大腦中動脈阻塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）模型，此法梗死灶大，神經(jīng)功能缺損嚴重，死亡率較高，無法觀察長期神經(jīng)功能變化，且術(shù)后大鼠核心溫度迅速升高，24 h內(nèi)維持在高于39℃的水平，這與臨床卒中后常見的高熱并發(fā)癥相似。卒中后1 h給藥使24 h梗死灶體積減少約40%，提示NA-1在梗死程度重、合并高熱的情況下仍起作用。實驗3制備tMCAO模型，給藥時間窗延長至卒中后3 h，觀察終點延長至卒中后62 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)卒中后24 h及62 d梗死灶體積分別減小了50%及80%，伴隨神經(jīng)功能恢復，提示NA-1給藥時間窗可延長至卒中后3 h并改善近、遠期神經(jīng)功能。

圖1 Tat-NR2B9（NA-1）可與PSD-95的PDZ1或PDZ2結(jié)合，干擾蛋白三聚體NMDAR/PSD-95/nNOs的形成，阻斷興奮性毒性信號的轉(zhuǎn)導[3]

除了證實NA-1的有效性，研究人員還利用嚙齒類動物模型進一步探討NA-1的作用機制。Bernt T.Br?tane等[4]在大鼠卒中后多個時間點進行核磁共振灌注加權(quán)成像（perfusion weighted imaging，PWI）和彌散加權(quán)成像（diffu?sion weighted imaging，DWI），通過DWI與PWI的不匹配觀察缺血半暗帶的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NA-1在不增加局部腦血流量的情況下明顯延緩缺血半暗帶的進展，提示NA-1有可能延長溶栓治療時間窗。

雖然NA-1在嚙齒類動物中展現(xiàn)了良好的神經(jīng)保護作用，但嚙齒類與靈長類動物在神經(jīng)解剖、生理等方面的差異，可造成兩者對藥物反應性不同[7-8]。根據(jù)2009年卒中治療學術(shù)行業(yè)圓桌會議（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR）的建議，除了嚙齒類動物，神經(jīng)保護治療需要在與人類有更高相似程度的多腦回（gyrencephalic）非人靈長類動物（nonhuman primates，NHPs）中得到研究[9]。

3 非人靈長類腦缺血動物模型中PSD-95抑制劑的神經(jīng)保護作用

NHPs研究多以狒狒為模型，其腦血管側(cè)支循環(huán)豐富，為提高模型制備的成功率，需同時閉塞一側(cè)大腦中動脈和雙側(cè)大腦前動脈。此法梗死灶較大，急性期死亡率高，并影響狒狒的雙目視力，不利于行為學檢測[8]。狨猴也常用于復制腦梗死模型，但其屬于缺腦回（lissencephalic）動物[8]。食蟹猴大腦無豐富的側(cè)支循環(huán)，屬多腦回，其腦組織和血管解剖與人類較相似。因此，Douglas J.Cook等[10]選擇食蟹猴（cynomolgus macaque）進行NA-1的相關(guān)研究，分別進行以下4個實驗。

實驗1夾閉發(fā)出眶額支近端，制備90 min tMCAO模型。卒中后1 h單次注射NA-1（2.6 mg/kg），卒中后4 h、24 h及30 d利用DWI、T2WI及組織學方法測量梗死灶大小，同時利用NHPSS（Nonhuman Primate Stroke Scale）評價神經(jīng)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卒中后24 h及30 d梗死灶體積較對照組減少55%和70%，伴隨神經(jīng)功能改善。實驗2夾閉眶額支遠端，制備pMCAO模型。卒中后1 h、6 h取缺血半暗帶組織活檢，提取其神經(jīng)元RNA行全基因組表達譜芯片雜交，證實NA-1有助于缺血神經(jīng)元保持內(nèi)源性保護性基因的轉(zhuǎn)錄功能。實驗3與實驗4通過動脈瘤夾的關(guān)閉和開放復制4.5 h及3.5 h tMCAO模型，模擬臨床溶栓后再灌注。分別于卒中后1 h及3 h給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥組梗死灶體積較對照組明顯減小，伴隨神經(jīng)功能改善，提示NA-1有可能與rt-PA聯(lián)用并延長其治療時間窗。

該研究是目前開展的最大樣本（n=62）NHPs研究，首次應用MRI技術(shù)評價NHPs的缺血半暗帶，并模擬臨床應用的NIHSS(National Institute of Health Stroke Scale)，采用NHPSS對NHPs卒中后近、遠期神經(jīng)功能進行綜合評價。研究仍存在一些問題：①平均每組的樣本量仍較少（n= 6-7），存在一定的抽樣誤差；②研究選擇的是雄性、年輕、健康、無并發(fā)癥的動物，與多有血管基礎(chǔ)病變的臨床實際不符，應考慮選擇不同性別、年齡及健康狀態(tài)的動物；③NHPSS評分的可靠性尚未得到充分肯定；④需要在血栓栓塞性腦卒中動物模型中進一步探討NA-1與rt-PA聯(lián)合治療的可能[11-12]。

Douglas J.Cook等[13]還根據(jù)當時正在進行的臨床試驗ENACT（Evaluating Neuroprotection in Aneurysm Coiling Therapy），設(shè)計了另一項NHPs研究。實驗人員從食蟹猴頸內(nèi)動脈注射多聚乙烯微球制備多發(fā)性腦栓塞模型，模擬人顱內(nèi)動脈瘤介入術(shù)后繼發(fā)的醫(yī)源性栓塞，1 h后單次給藥，24 h及30 d后利用MRI和組織學檢查，發(fā)現(xiàn)NA-1可明顯減少卒中病灶數(shù)目和大?。s64%、64%）。此結(jié)果與ENACT基本一致，提示該靈長類動物模型實驗結(jié)果對臨床試驗結(jié)果預測是有效的，該模型可能也適用于其他神經(jīng)保護藥的研究。

4 臨床研究初步證實PSD-95抑制劑的有效性和安全性

與Douglas J.Cook模擬顱內(nèi)動脈瘤介入術(shù)后繼發(fā)腦栓塞的NHPs研究相對應，自2008年到2011年開展了一項II期、多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照臨床試驗ENACT（ClinicalTrials.gov.Indentifier：NCT00728182），初步證實NA-1在防治顱內(nèi)動脈瘤介入術(shù)后繼發(fā)腦栓塞的有效性和安全性。此項研究共入組185例患者，包括顱內(nèi)動脈瘤未破裂或已破裂繼發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血，在行血管介入術(shù)后馬上靜脈給予NA-1（2.6mg/kg），12～96 h內(nèi)進行MRI檢查，發(fā)現(xiàn)NA-1可減少繼發(fā)卒中的病灶數(shù)量，但對病灶大小沒有影響。而亞組分析顯示，NA-1不僅能減少動脈瘤破裂組卒中病灶數(shù)量，還能減小病灶體積。但該亞組樣本量不足（n=37）。研究過程中，NA-1給藥組未出現(xiàn)明顯的毒副反應，部分患者在給藥后24 h出現(xiàn)短暫的低血壓（舒張壓下降約9 mmHg），但數(shù)分鐘內(nèi)自行恢復[14]。

臨床上，除了顱內(nèi)動脈瘤介入術(shù)，頸內(nèi)動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)、頸內(nèi)動脈支架植入術(shù)、房顫射頻消融術(shù)等都有出現(xiàn)繼發(fā)醫(yī)源性栓塞的風險[15-16]。這種類型的卒中一般累及終末小動脈，無明顯的感覺運動功能缺失，因此未引起足夠重視。但嚴重的多發(fā)小梗死灶可損害認知功能，造成血管性癡呆[17]。在這些患者中，NA-1能做到術(shù)后早期給藥以發(fā)揮神經(jīng)保護作用，具有良好的發(fā)展前景。

5 問題與展望

PSD-95為卒中后神經(jīng)保護治療提供了一個新靶點。PSD-95抑制劑通過特異性地干擾PSD-95與NMDAR及其下游信號分子的結(jié)合，阻斷興奮性毒性信號的傳導，從離體細胞實驗到小樣本人體試驗均顯示出良好的神經(jīng)保護作用，其研究成果對指導未來其他神經(jīng)保護藥的研究有重要的借鑒意義。

目前一項II期臨床試驗ENACT-2（ClinicalTrials.gov. Indentifier：NCT02056574）將于2015年～2019年開展，計劃入組300例顱內(nèi)動脈瘤破裂繼發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血的患者，以驗證NA-1在防治此類病人血管介入治療后繼發(fā)腦栓塞的有效性和安全性[18]。另一項III期臨床試驗Field Ran?domization of NA-1 Therapy in Early Responders（FRON?TIER）也將于2015年～2017年開展，計劃入組558名急性腦缺血患者，在入院前卒中起病3 h內(nèi)為患者注射NA-1，進一步評估NA-1的有效性和安全性[18]。這些臨床試驗結(jié)果值得期待。

NA-1臨床研究的初步成功使PSD-95抑制劑受到廣泛的關(guān)注，許多研究團隊致力于開發(fā)新藥物，提高其生物學效應。Tat-N-dimer是一種二聚體配體，將作用于PSD-95氨基端2個PDZ結(jié)構(gòu)域的兩種多肽連接，在體外細胞及小鼠中初步證實比單體NA-1有更強的親和力和更長的半衰期[19]。由于肽類藥物存在易被蛋白水解酶降解、給藥途徑受限、生產(chǎn)費用較高、可能存在免疫排斥等缺點，Zhou等[21]設(shè)計并合成出一種非肽類小分子藥物ZL006，可破壞nNOs β-finger結(jié)構(gòu)，干擾PSD-95與nNOs的結(jié)合，在離體細胞及小鼠中初步證實其具有神經(jīng)保護作用。上述PSD-95新型抑制劑的有效性和安全性仍需更多臨床前及臨床研究結(jié)果的支持。

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R743(

2014-11-14）

A（責任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.06.014

* 中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣州 510080）

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