β2腎上腺素能受體基因多態(tài)性與早發(fā)重癥肌無(wú)力關(guān)系研究

王莉莉張運(yùn)賀茂林

·論 著·

β2腎上腺素能受體基因多態(tài)性與早發(fā)重癥肌無(wú)力關(guān)系研究

王莉莉*張運(yùn)*賀茂林*

目的探討β2腎上腺素能受體(β2 adrenergic receptor,β2-AR)16位點(diǎn)基因多態(tài)性與不同臨床表型的早發(fā)重癥肌無(wú)力（myasthenia gravis,MG）的關(guān)系。方法105例MG患者，其中起病年齡≤40歲的早發(fā)MG為48例。根據(jù)胸腺影像將早發(fā)MG患者分為胸腺正常組(13例)、胸腺增生組(22例)和胸腺瘤組（7例），未知6例。根據(jù)性別分為女性組(31例)和男性組(17例)，根據(jù)首發(fā)癥狀分為OMG組(29例)和GMG組(19例)，根據(jù)伴發(fā)其他自身免疫疾病情況分為伴發(fā)(10例)和不伴發(fā)(33例)其他自身免疫性疾病組，未知5例。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的兩組間β2-AR基因16位點(diǎn)多態(tài)性分布差異。結(jié)果胸腺正常的早發(fā)MG患者16位點(diǎn)基因型以Arg/ Arg（53.8%）為主，胸腺增生以Arg/Arg（54.6%）為主，胸腺瘤以Arg/Gly（71.4%）為主，3組間3種基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.657，P=0.226)。女性早發(fā)MG患者16位點(diǎn)基因型以Arg/Arg（58.1%）為主，男性早發(fā)MG患者以Arg/Gly（58.8%）為主，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.064，P=0.048)。首發(fā)OMG組以Arg/Arg（48.3%）基因型為主，GMG組Arg/Arg（42.1%）和Arg/Gly（47.4%）比例相似，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.623，P=0.444)。伴發(fā)其他自身免疫性疾病組以Arg/Arg（80.0%）為主，不伴發(fā)組以Arg/Gly（39.4%）為主，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 6.394，P=0.041)。結(jié)論β2-AR基因16位點(diǎn)基因多態(tài)性與不同性別的早發(fā)型MG相關(guān)；與伴發(fā)其他自身免疫性疾病的早發(fā)型MG相關(guān)。

重癥肌無(wú)力 β2腎上腺素能受體 基因多態(tài)性 單核苷酸

重癥肌無(wú)力(myasthenia grads，MG)是累及神經(jīng)肌肉接頭的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病。MG的發(fā)病機(jī)制還未完全清楚，神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)是近年來(lái)國(guó)際上神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。β2-腎上腺素能受體（β2-adrener?gic receptor,β2-AR）是一種在體內(nèi)廣泛分布的G蛋白偶聯(lián)受體，介導(dǎo)交感神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控免疫系統(tǒng)的功能。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)β2-AR16位點(diǎn)基因多態(tài)性主要與晚發(fā)型MG相關(guān),與早發(fā)型MG無(wú)關(guān)[1]。但β2-AR16位點(diǎn)基因多態(tài)性與不同臨床表型的早發(fā)MG是否相關(guān)還未闡明。我們探討β2-AR基因多態(tài)性與早發(fā)MG不同臨床表型的關(guān)系，尋找早發(fā)MG不同臨床表型的可能機(jī)制，為不同臨床表型的早發(fā)MG藥物治療提供新的研究靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象所有入組MG病例均來(lái)自2002～2012年在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診和病房患者，診斷明確的重癥肌無(wú)力患者共105例，其中早發(fā)型MG48例，女性31例，男性17例。年齡中位數(shù)37歲（4～52歲）。胸腺增生MG22例，胸腺瘤7例，胸腺正常13例，胸腺影像未知6例。眼肌型發(fā)病者29例，全身型發(fā)病者19例。伴發(fā)其他自身免疫性疾病者10例（伴發(fā)Graves病和橋本甲狀腺炎共9例、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎1例），不伴發(fā)其他自身免疫性疾病者33例,未知5例。Graves病是指患者具備高代謝的癥狀和體征；甲狀腺腫大；血清TT4、FT4增高和TSH減低。具備以上3項(xiàng)診斷即可成立。橋本甲狀腺炎指甲狀腺?gòu)浡阅[大；甲狀腺功能正常或減低；血清甲狀腺球蛋白（thyroglobulin,TG）抗體和甲狀腺過(guò)氧化物酶（thyroid peroxidase,TPO）抗體滴度顯著升高。具備上述3項(xiàng)診斷可成立。胸腺異常為影像學(xué)診斷結(jié)果。本研究得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。全部受試者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 MG診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]和排除標(biāo)準(zhǔn)①骨骼肌無(wú)力，有典型活動(dòng)后加重、休息后減輕或“晨輕暮重”特征；疲勞試驗(yàn)陽(yáng)性；②新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性；③肌電圖檢查顯示低頻重復(fù)電刺激波幅遞減和(或)單纖維肌電圖顫抖(jitter)增寬；④血清AChR抗體增高。MG入組標(biāo)準(zhǔn)：所有患者符合MG診斷標(biāo)準(zhǔn)①，并且就診時(shí)至少符合MG診斷標(biāo)準(zhǔn)②③④中的任意一條。MG排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠患者；②合并心臟、肺臟、肝臟、腎臟等器官功能不全者。

1.3 研究方法①DNA的提?。旱聡?guó)QIAGEN試劑盒法提取外周靜脈EDTA抗凝血DNA。②PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法：β-AR上游引物為5’-CAGC?CAGTGCGCTTACCTGC-3’,下游引物為5’-CA?CAGCACAT CAATGGAAGTC-3’。PCR反應(yīng)體系為50 μL,含有DNA模板4 μL；20 pmol/μL濃度的上、下游引物各0.4 μL；2×PCR mix 25 μL（包括EasyTaq DNA聚合酶、dNTP和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液）；ddH2O20.2 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,然后開(kāi)始循環(huán)：94℃變性40 s,58℃退火60s,72℃延伸60 s,35個(gè)循環(huán),最后在72℃延伸5min。將PCR產(chǎn)物原液純化后應(yīng)用ABI3730測(cè)序儀測(cè)序以確定個(gè)體基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。組間等位基因和基因型顯著性比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 β2-AR 16位點(diǎn)基因型β2-AR 16位點(diǎn)精氨酸（Arg）被甘氨酸（Gly）所取代[3]。共檢出16多態(tài)位點(diǎn)的3種基因型(Arg/Gly、Arg/Arg、Gly/Gly,見(jiàn)圖1所示)。早發(fā)MG臨床表型各組的基因多態(tài)分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 β2-AR16位點(diǎn)基因多態(tài)性與早發(fā)MG患者胸腺異常的關(guān)系首先比較早發(fā)MG患者16位點(diǎn)的3種基因型在胸腺正常組、胸腺增生組和胸腺瘤組中的分布差異。如表1所示，β2-AR16位點(diǎn)3種基因型在3組的分布經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組的16位點(diǎn)等位基因Arg16、16Gly間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 β2-AR16位點(diǎn)基因多態(tài)性與不同首發(fā)癥狀早發(fā)MG患者的關(guān)系比較16位點(diǎn)的3種基因型在早發(fā)OMG起病組和GMG起病組中的分布差異。如表1所示，β2-AR16位點(diǎn)3種基因型在OMG和GMG的分布經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩個(gè)組的16位點(diǎn)等位基因Arg16、16Gly在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 β2-AR 16位點(diǎn)突變基因測(cè)序圖（箭頭標(biāo)記處為突變位點(diǎn)）

表1 β2-AR16位點(diǎn)基因多態(tài)性與早發(fā)MG患者不同臨床表型的關(guān)系[n(%)]

2.4 β2-AR16位點(diǎn)基因多態(tài)性與不同性別早發(fā)MG患者的關(guān)系觀察β2-AR16位點(diǎn)基因型在女性和男性早發(fā)MG患者分布的差異，結(jié)果如表1所示，χ2值為6.064，P值為0.048。三種基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.5 β2-AR16位點(diǎn)基因多態(tài)性與MG患者是否伴發(fā)其他自身免疫性疾病的關(guān)系為觀察哪種基因型早發(fā)MG患者易伴發(fā)其他自身免疫性疾病,我們將MG患者分為伴發(fā)其他自身免疫性疾病組和不伴發(fā)其他自身免疫性疾病組，比較兩組間16位點(diǎn)基因型差異，結(jié)果（見(jiàn)表1）顯示χ2值6.394，P值0.041。等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

我們的研究探討了β2-AR基因多態(tài)性與早發(fā)MG不同臨床表型的關(guān)系，初步揭示了早發(fā)MG不同臨床表型的可能機(jī)制。我們的研究結(jié)果顯示β 2-AR基因16位點(diǎn)基因多態(tài)性與不同性別的早發(fā)型MG相關(guān)，與伴發(fā)其它自身免疫性疾病的早發(fā)型MG相關(guān)，與伴發(fā)胸腺異常的早發(fā)型MG無(wú)關(guān)，與不同首發(fā)癥狀的早發(fā)MG無(wú)關(guān)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)女性早發(fā)MG患者16位點(diǎn)基因型以Arg/Arg為主，男性早發(fā)MG患者以Arg/Gly為主。既往國(guó)外研究結(jié)果顯示早發(fā)女性MG患者Arg16純合子明顯高表達(dá)，這與我們的研究結(jié)果一致[4]。

胸腺瘤多見(jiàn)于晚男性MG患者[5],迄今為止尚無(wú)早發(fā)型MG胸腺異常與β2-AR16位點(diǎn)基因型關(guān)系的報(bào)道。我們研究結(jié)果顯示胸腺正常的早發(fā)MG患者16位點(diǎn)基因型以Arg/Arg為主，胸腺增生以Arg/Arg為主，胸腺瘤以Arg/Gly為主，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)胸腺瘤組Arg/ Arg基因型明顯高于健康對(duì)照組。胸腺增生組Arg/Arg和Gly/Gly比例明顯高于健康對(duì)照組[4]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺瘤、胸腺增生和胸腺正常組間上述三種基因型分布均無(wú)顯著性差異[1]。

我們研究結(jié)果還顯示首發(fā)OMG組以Arg/Arg基因型為主，GMG組Arg/Arg和Arg/Gly比例相似。OMG與GMG組間三種基因型分布無(wú)顯著性差異。既往研究顯示MG患者與健康對(duì)照組比較Arg/Arg差異顯著，這種差異主要與GMG包括由OMG轉(zhuǎn)化來(lái)的GMG相關(guān)，與單純OMG無(wú)關(guān)[4]。目前尚無(wú)早發(fā)型MG不同首發(fā)癥狀與β2-AR16位點(diǎn)基因型關(guān)系的報(bào)道。

既往研究發(fā)現(xiàn)伴發(fā)其他自身免疫性疾病的MG患者與不伴發(fā)其他自身免疫性疾病的MG患者相比有獨(dú)特的臨床特征，如常多發(fā)生于女性，常伴有胸腺增生，輕度全身型表型多見(jiàn)[6,7]。伴發(fā)的其它自身免疫性疾病包括甲狀腺異常、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、格林巴利綜合征[8]等，其中甲狀腺功能異常最多見(jiàn)。我們分析了伴發(fā)與不伴發(fā)其他自身免疫性疾病的早發(fā)型MG患者β2-AR16位點(diǎn)基因型分布的差異，結(jié)果顯示伴發(fā)組以Arg/Arg為主，不伴發(fā)組以Arg/Gly為主，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種β2-AR16位點(diǎn)基因型分布的差異是否與伴發(fā)其他自身免疫性疾病的MG患者的臨床特點(diǎn)相關(guān)還需要進(jìn)一步研究。目前國(guó)內(nèi)外也尚無(wú)伴發(fā)其他自身免疫性疾病的早發(fā)型MG與β2-AR16位點(diǎn)基因型關(guān)系的報(bào)道。

我們研究證明了β2-AR 16位點(diǎn)基因多態(tài)性與早發(fā)MG性別差異有關(guān)，并證明了該位點(diǎn)多態(tài)性與早發(fā)MG伴發(fā)其他自身免疫性疾病相關(guān)。但該位點(diǎn)基因型分布差異與早發(fā)MG不同臨床表型關(guān)系的機(jī)制尚待闡明。這可能與影響β2-AR活性或淋巴細(xì)胞表面分子相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)β2-AR16氨基酸位點(diǎn)多態(tài)性改變了受體表達(dá)和功能，從而影響了疾病的易感性及臨床表現(xiàn)多樣性[9]。Arg16是否通過(guò)引起β2-AR活性改變進(jìn)一步影響機(jī)體的免疫功能有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

國(guó)內(nèi)外大量研究已經(jīng)證明，β2-AR16位氨基酸位點(diǎn)多態(tài)性影響β2-AR激動(dòng)劑的療效。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)攜有Glyl6患者對(duì)舒喘靈的治療效果較攜有Arg16的患者差[10]。國(guó)外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β2-AR受體激動(dòng)劑特布他林可以改善MG患者癥狀[11]，我們的研究證實(shí)了Arg16純合子與女性早發(fā)MG的關(guān)系以及與伴發(fā)其它自身免疫性疾病的早發(fā)MG的關(guān)系，也為β2-AR受體激動(dòng)劑應(yīng)用于治療上述兩類(lèi)患者提供了理論依據(jù)。

我們的研究還有一定的缺陷，首先是病人來(lái)源相對(duì)單一，例數(shù)較少。第二是本研究伴發(fā)自身免疫性疾病的患者多以甲狀腺異常為主，其他自身免疫性疾病少見(jiàn)。還需要后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大研究來(lái)證實(shí)目前結(jié)論。

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The relationship between β2-adrenergic receptor polymorphisms and early onset Myasthenia Gravis.

WANG Lili,ZHANG Yun，HE Maolin.Department of Neurology,Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Bei?jing 100038，China.Tel:010-63926556.

ObjectiveTo explore the correlation of β2-adrenergic receptor(β2-AR)polymorphisms(Arg16Gly) with early onset Myasthenia Gravis(MG).MethodsForty-eight with age less than 40 years at disease onset were divided into three groups:normal thymus(13 cases),thymic hyperplasia(22 cases)and thymoma(7 cases)groups according to the thymus histology.These patients were further divided into different subgroups including female(31 cases)and male groups(17 cases)based on the gender,OMG(29 cases)and GMG(19 cases)groups according to the symptom of disease onset and groups associated with(10 cases)or without(33cases)other autoimmune diseases Or with unknown causes(5 cases).The genotypes of β2-AR in 48 early onset MG were determined by gene sequencing.ResultsArg/Arg was more common in early MG patient with normal thymus(53.8%）and thymic hyperplasia（54.6%）whereas Arg/Gly was more common in thymus group（71.4%）.The difference in distribution of the genotypes between the three groups was not statis?tically significant(χ2=5.657，P=0.226).Arg/Arg was more common in early female MG patient(58.1%)and Arg/Gly was more common in male MG patients(58.8%).The difference in distribution of the genotypes between the two groups wasstatistically significant(χ2=6.064，P=0.048).Arg/Arg was more common in early OMG patient(48.3%).Arg/Arg(42.1%) and Arg/Gly(47.4%)were equal common in GMG patients.The difference in distribution of the genotypes between the two groups was statistically significant(χ2=1.623，P=0.444).Arg/Arg was more common in early MG patient associated with other autoimmune diseases(80.0%).Arg/Gly was more common in MG patients without other autoimmune diseases (39.4%).The difference in distribution of the genotypes between the three groups was statistically significant(χ2=6.394，P=0.041).Conclusionβ2-AR gene polymorphism in position 16 is associated with gender and other autoimmune diseas?es in patients with early onset of MG.

Myasthenia gravis β2-adrenergic receptor Polymorphism Single nucleotide

R746.1

A

2014-09-08）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.06.007

* 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（北京100038）