高強(qiáng)度聚焦超聲治療對(duì)裸鼠皮下膠質(zhì)瘤VEGF、PCNA表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的影響☆

肖文峰李俊霍鋼翟安林鄭履平

·論 著·

高強(qiáng)度聚焦超聲治療對(duì)裸鼠皮下膠質(zhì)瘤VEGF、PCNA表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的影響☆

肖文峰*李俊*霍鋼△翟安林*鄭履平△

目的通過(guò)觀察高強(qiáng)度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound，HIFU)對(duì)裸鼠皮下人膠質(zhì)瘤模型作用后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear anti?gen，PCNA)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞的凋亡，探討HIFU治療后對(duì)交界區(qū)及照射區(qū)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響。方法建立18只裸鼠左右背部皮下膠質(zhì)瘤模型，用頻率9.7MHz，焦距4.5mm，聲強(qiáng)2500W/cm2的HIFU連續(xù)照射20s。按照射后動(dòng)物處死時(shí)間隨機(jī)分為7d組，14d組，30d組，每組各6只裸鼠即12個(gè)皮下膠質(zhì)瘤組織；應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)HIFU作用后第7d、14d、30d照射區(qū)、交界區(qū)、正常區(qū)VEGF、PCNA蛋白的表達(dá)；應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)照射區(qū)、交界區(qū)、正常區(qū)的凋亡細(xì)胞。結(jié)果免疫組化觀察到，各時(shí)刻點(diǎn)交界區(qū)及正常區(qū)均有VEGF及PCNA表達(dá)并檢測(cè)到凋亡染色陽(yáng)性的細(xì)胞，照射區(qū)均無(wú)PCNA蛋白的表達(dá)及未檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。第7d時(shí)交界區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(23.79%±3.11%)低于正常區(qū)(46.16%± 2.43%)(F=110.03,P＜0.05)；照射區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(10.94%±3.95%)低于正常區(qū)(46.16%±2.43%)(F=272.80，P＜0.05)。第14d時(shí)交界區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(17.17%±2.89%)低于正常區(qū)(43.47%±3.77%)(F=152.05,P＜0.05)；第30d時(shí)交界區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(9.27%±2.08%)低于正常區(qū)(44.58%±3.34%)(F=274.1,P＜0.05 2)。交界區(qū)的PCNA標(biāo)記指數(shù)(PCNA labeling index，PCNA LI)(33.04%±4.31%)在第7d時(shí)低于正常區(qū)(65.15%±3.85%)，(F=242.46,P＜0.05)；在14d時(shí)為(21.05%±1.96%)低于正常區(qū)(62.99%±3.34%)(F=413.52,P＜0.05)；在30d時(shí)為(6.36%± 0.51%)低于正常區(qū)(62.07%±18.07%)(F=729.59,P＜0.05)。第7d時(shí)交界區(qū)的凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)(26.10%± 4.54%)高于正常區(qū)(1.43%±0.35%)(F=216.22,P＜0.05)。14d時(shí)交界區(qū)的凋亡指數(shù)AI(65.70%±1.14%)高于正常區(qū)(1.82%±0.31%)(F=1448.64,P＜0.05)；30d時(shí)交界區(qū)的凋亡指數(shù)AI(82.02%±3.98%)高于正常區(qū)(2.52%±0.29%)(F= 2244.33,P＜0.05)。結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定參數(shù)及聲學(xué)劑量情況下,HIFU除了對(duì)照射區(qū)組織產(chǎn)生直接的殺滅作用外，還能抑制交界區(qū)的細(xì)胞增殖以及誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

高強(qiáng)度聚焦超聲 膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡

☆ 重慶市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目（編號(hào)：04-2-196）

△ 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科

在前期研究中，我們不僅觀察到高強(qiáng)度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound，HIFU)對(duì)照射區(qū)的腫瘤組織具有確切、可靠的殺滅作用，能使照射區(qū)組織細(xì)胞發(fā)生典型的凝固性壞死改變，還可觀察到壞死區(qū)與正常區(qū)之間有一個(gè)區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)沒(méi)有觀察到膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生典型的凝固性壞死，而是出現(xiàn)組織淺染、細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞皺縮等改變，并且隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)細(xì)胞大小不等，胞漿濃縮，呈強(qiáng)嗜酸性等改變，我們稱(chēng)之為交界區(qū)[1]。在此研究中，我們將通過(guò)免疫組化及原位末端標(biāo)記法，觀察HIFU作用后皮下膠質(zhì)瘤組織7d、14d、30d照射區(qū)、交界區(qū)及正常區(qū)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)蛋白表達(dá)以及凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，進(jìn)一步研究HIFU對(duì)膠質(zhì)瘤的治療作用及治療的安全性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象4～6周齡裸小鼠18只，每只質(zhì)量20～30 g，雌性，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG-44由蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院黃強(qiáng)教授建系，由第三軍醫(yī)大學(xué)病理教研室提供。用1640培養(yǎng)液（含10%新生小牛血清、青霉素G 100mg/mL、鏈霉素100mg/mL）于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng),取同一代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并調(diào)細(xì)胞密度為5×107mL-1；局部消毒條件下于裸小鼠左右背部皮下各射0.2mL細(xì)胞懸液，建立裸鼠皮下膠質(zhì)瘤模型。18只裸鼠全部成瘤,成瘤率100%。按HIFU作用后動(dòng)物處死時(shí)間即7d，14d，30d分為3個(gè)組，每組各6只裸鼠即12個(gè)皮下膠質(zhì)瘤組織。

1.2 方法CZF-II型超聲治療儀，由重慶海扶技術(shù)有限公司研制，重慶醫(yī)科大學(xué)超聲工程研究所提供，由功率源、治療探頭及循環(huán)脫氣水降溫系統(tǒng)三部分組成。本研究采用的治療探頭頻率為9.7MHZ,直徑9.5mm，焦距4.5mm，脈沖1 MHZ，最大輸出功率5W,焦點(diǎn)處聲強(qiáng)2500W/cm2。裸鼠固定于特制鼠板上，腫瘤表面涂以超聲耦合劑，輸入治療參數(shù)，將探頭置于涂有超聲耦合劑的腫瘤表面，采用以上治療參數(shù)連續(xù)照射20s。于照射后7d、14d、30d時(shí)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取皮下膠質(zhì)瘤組織制作常規(guī)石蠟切片，行免疫組化：PCNA、VEGF檢測(cè)以及TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)。觀察不同時(shí)刻點(diǎn)照射區(qū)、交界區(qū)、正常區(qū)PCNA、VEGF和細(xì)胞凋亡情況。VEGF陽(yáng)性染色呈黃色或棕黃色，局限于細(xì)胞漿，血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見(jiàn)陽(yáng)性染色；在每張組織切片陽(yáng)性染色均勻區(qū)域，隨機(jī)選取l0個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)，即陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)并取平均值。PCNA陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色或棕褐色顆粒或彌漫性分布；TUNEL法檢測(cè)的凋亡細(xì)胞，其陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核，呈棕黃色彌漫性分布；在高倍(×400)顯微鏡下觀察，在每張組織切片陽(yáng)性反應(yīng)均勻的區(qū)域，隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，分別以PCNA陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例以及凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)作為PCNA標(biāo)記指數(shù)(PCNA labeling index，PC?NA LI)和凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)用±s表示，數(shù)據(jù)處理在SAS8.2上完成。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用兩因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 正常區(qū)、交界區(qū)及照射區(qū)VEGF的表達(dá)在正常區(qū)域，腫瘤細(xì)胞VEGF染色呈棕黃色彌漫性分布，腫瘤滋養(yǎng)血管的內(nèi)皮細(xì)胞也成陽(yáng)性反應(yīng)；在交界區(qū)域，腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)率明顯降低，VEGF陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞大多呈淺黃色，血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)著色；在照射區(qū)域，第7d時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞大體輪廓尚存，并有VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)，第14d、30d時(shí)未見(jiàn)有完整的細(xì)胞形態(tài)，僅可見(jiàn)細(xì)胞殘片和纖維結(jié)締組織的黃色背景(圖1)。第7d時(shí)交界區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(23.79%±3.11%)低于正常區(qū)(46.16%± 2.43%)(F=110.03,P＜0.05)；照射區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(10.94%±3.95%)低于正常區(qū)(46.16%± 2.43%)(F=272.80，P＜0.05)。第14d時(shí)交界區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(17.17%±2.89%)低于正常區(qū)(43.47%±3.77%)(F=152.05,P＜0.05)；第30d時(shí)交界區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(9.27%±2.08%)低于正常區(qū)(44.58%±3.34%)(F=274.1,P＜0.05 2)。見(jiàn)表1。2.2正常區(qū)、交界區(qū)及照射區(qū)PCNA的表達(dá)PC?NA表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色或棕褐色顆粒或彌漫性分布。HIFU作用后7d時(shí)，交界PCNA LI (33.04%±4.31%)低于正常區(qū)(65.15%±3.85%)(F= 242.46,P＜0.05)；在14d時(shí)為(21.05%±1.96%)低于正常區(qū)(62.99%±3.34%)(F=413.52,P＜0.05)；在30d時(shí)為(6.36%±0.51%)低于正常區(qū)(62.07%±18.07%)(F= 729.59,P＜0.05)。照射區(qū)未觀察到PCNA陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，細(xì)胞全部發(fā)生凝固性壞死(圖2，表1)。

圖1 A：HIFU作用后7 d，正常區(qū)（下）及交界區(qū)（上）VEGF的表達(dá)（×400）;B：HIFU作用后7 d，照射區(qū)VEGF的表達(dá)（×400）；C：HIFU作用后30 d，正常區(qū)（上）及交界區(qū)（下）VEGF的表達(dá)（× 400）

2.3 正常區(qū)、交界區(qū)及照射區(qū)凋亡的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL法，對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞核被染成棕黃色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。第7d時(shí)交界區(qū)AI(26.10%±4.54%)高于正常區(qū)(1.43%±0.35%)(F= 216.22,P＜0.05)。14d時(shí)交界區(qū)的凋亡指數(shù)AI (65.70%±1.14%)高于正常區(qū)(1.82%±0.31%)(F= 1448.64,P＜0.05)；30d時(shí)交界區(qū)的凋亡指數(shù)AI (82.02%±3.98%)高于正常區(qū)(2.52%±0.29%)(F= 2244.33,P＜0.05)。照射區(qū)未觀察到凋亡細(xì)胞，細(xì)胞全部發(fā)生凝固性壞死(圖3，表1)。

圖2 A：HIFU作用后7 d，正常區(qū)（下）及交界區(qū)（上）PCNA的表達(dá)（×400）；B：HIFU作用后14 d，正常區(qū)（右）及交界區(qū)（左）PCNA的表達(dá)（×400）；C：HIFU作用后30 d，正常區(qū)（左）及交界區(qū)（右）PC?NA的表達(dá)（×400）；D：HIFU作用后30 d，照射區(qū)（右）及交界區(qū)（左）PCNA的表達(dá)（×400）

圖3 A：HIFU作用后7 d，正常區(qū)（左）及交界區(qū)（右）凋亡細(xì)胞的觀察（×400）；B：HIFU作用后14 d，交界區(qū)凋亡細(xì)胞的觀察（×400）；C：HIFU作用后30 d，交界區(qū)凋亡細(xì)胞的觀察（×400）

表1 HIFU作用后第7、14、30d時(shí)，正常區(qū)、交界區(qū)、照射區(qū)VEGF、PCNA的表達(dá)及細(xì)胞凋亡指數(shù)

3 討論

高強(qiáng)度聚焦超聲在短時(shí)間內(nèi)，使焦域溫度迅速升高到65℃以上，從而使焦域內(nèi)組織發(fā)生不可逆的凝固性壞死。李發(fā)琪等[2]采用頻率1.6 MHz，焦距120mm，焦點(diǎn)處聲強(qiáng)0～27000W/cm2的HIFU作用新鮮離體牛肝臟發(fā)現(xiàn)，焦點(diǎn)處溫度為74.4℃± 1.5℃，焦點(diǎn)外6mm處溫度為47.5℃，9mm處為27.5℃。何申戌等[3]分別以活體豬腎、肝、膀胱、結(jié)腸壁、卵巢及大血管作為靶組織進(jìn)行體外聚焦熱療實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)離焦點(diǎn)6.8 mm處溫度在60℃左右, 13.6 mm處溫度在45℃～50℃，20.4 mm處溫度在40℃左右?？梢?jiàn)，HIFU作用時(shí)，溫度以焦點(diǎn)為中心向周?chē)鷶U(kuò)散；焦域外仍有損傷作用并隨離焦點(diǎn)距離的增大而減弱。在焦域內(nèi)，溫度能迅速升高到65℃以上，使組織發(fā)生凝固性壞死；在焦域外，由于溫度下降迅速，不能使組織發(fā)生即刻的凝固性壞死，而是引起一個(gè)亞急性的損傷區(qū)域我們稱(chēng)之為交界區(qū)。正如我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在HIFU照射的焦域內(nèi)，膠質(zhì)瘤組織發(fā)生了典型的凝固性壞死改變；在HIFU作用后第7d時(shí)，可觀察到壞死區(qū)與正常區(qū)之間的交界區(qū)的形成，在交界區(qū)沒(méi)有觀察到膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生典型的凝固性壞死，而是出現(xiàn)組織淺染、細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞皺縮等改變，并且隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)細(xì)胞大小不等，胞漿濃縮，呈強(qiáng)嗜酸性等改變。所以，我們?cè)诖搜芯客ㄟ^(guò)免疫組化及原位末端標(biāo)記法，進(jìn)一步研究HIFU作用后7d、14d、30d照射區(qū)、交界區(qū)和正常區(qū)VEGF、PCNA蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的測(cè)定。

大量研究表明，VEGF在膠質(zhì)瘤中有表達(dá)，與膠質(zhì)瘤新生血管的生成、腫瘤的生長(zhǎng)相關(guān)，并且還可反應(yīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度[4,5]。本研究發(fā)現(xiàn)，HIFU作用后第7d時(shí)，照射區(qū)VEGF有表達(dá)，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為10.94%；Wu等[6]用HIFU對(duì)23名乳腺癌患者進(jìn)行治療，行免疫組化染色，結(jié)果他們也發(fā)現(xiàn)在治療區(qū)域存在VEGF陽(yáng)性染色，其陽(yáng)性表達(dá)率為30%。可見(jiàn)HIFU作用后，照射區(qū)腫瘤細(xì)胞的VEGF蛋白仍部分存在，但可觀察到細(xì)胞核發(fā)生明顯的固縮、碎裂等改變，說(shuō)明細(xì)胞已失去活力。HIFU作用后第7d、14d、30d時(shí)，交界區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與正常區(qū)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明HIFU能抑制交界區(qū)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的血管生成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

PCNA是一種分子量為36 kU的多肽，僅在增殖細(xì)胞中合成，在腫瘤細(xì)胞中明顯增加。用免疫組化方法標(biāo)記PCNA并通過(guò)陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)而得到的PCNA LI，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)和反映細(xì)胞增殖的指標(biāo)。PCNA LI越高，意味著處于S期的細(xì)胞越多，腫瘤增殖活性越高。劉振林等[7]通過(guò)對(duì)50例膠質(zhì)瘤標(biāo)本研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤分級(jí)及惡性程度越高，PCNA標(biāo)記指數(shù)(PCNA labeling index，PCNA LI)就顯著增高；李利敏等[8]也研究發(fā)現(xiàn)，PCNA的表達(dá)隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而升高。因此PCNA可被用于研究腫瘤的細(xì)胞增殖和判斷其惡性程度，對(duì)腫瘤的治療和預(yù)后的判斷有重要的意義。牛陵川等[9]研究發(fā)現(xiàn)在高強(qiáng)度聚焦超聲作用后，照射區(qū)內(nèi)乳腺癌組織發(fā)生凝固性壞死，PCNA不表達(dá)；而殘留的腫瘤組織細(xì)胞增殖活性明顯降低。我們的研究中發(fā)現(xiàn)，HIFU作用后，照射區(qū)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PC?NA LI為0；交界區(qū)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PCNA LI隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明HIFU不僅能直接殺滅腫瘤細(xì)胞，還能通過(guò)降低腫瘤的增殖活性來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。

TUNEL法是一種研究細(xì)胞凋亡的方法，該方法又被稱(chēng)為DNA缺口末端標(biāo)記（DNA nick end la?beling），也稱(chēng)原位加尾技術(shù)（in situ tailing）。研究表明，TUNEL法的敏感性高，尤其在凋亡的早期，且標(biāo)記強(qiáng)度大，背景染色低，所需時(shí)間短。所以我們選擇用TUNEL法來(lái)獲得HIFU治療膠質(zhì)瘤后各個(gè)區(qū)域的凋亡指數(shù)即AI。朱學(xué)強(qiáng)等[10]研究高強(qiáng)度聚焦超聲治療乳腺癌后靶區(qū)腫瘤細(xì)胞的病理學(xué)變化和細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，23例病人HIFU治療后靶區(qū)乳腺癌組織發(fā)生凝固性壞死，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)胞漿濃縮，核固縮，核碎裂等變化，但未檢測(cè)到凋亡染色陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。我們也研究發(fā)現(xiàn)，在HIFU作用后的照射區(qū)，未觀察到凋亡染色陽(yáng)性細(xì)胞，而是典型的凝固性壞死改變的細(xì)胞；但我們還發(fā)現(xiàn)，在照射區(qū)以外的交界區(qū)則出現(xiàn)了大量的凋亡細(xì)胞，并且隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，AI逐漸變大；各時(shí)刻點(diǎn)與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這又進(jìn)一步說(shuō)明了HIFU不僅能直接殺滅腫瘤細(xì)胞，還能誘導(dǎo)照射區(qū)外一定范圍的組織細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

綜上所述，HIFU除了對(duì)照射區(qū)組織產(chǎn)生直接的殺滅作用外；還能降低交界區(qū)細(xì)胞VEGF、PCNA蛋白的表達(dá)以及誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但其具體機(jī)制尚不明了。HIFU作用后交界區(qū)的產(chǎn)生，增加了HIFU的作用范圍，認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn)，對(duì)HIFU治療的組織生物學(xué)焦域及安全性的研究具有重要的意義。

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（責(zé)任編輯:甘章平）

The effect of high intensity focused ultrasound on VEGF and PCNA expression and apoptosis of subcutane?ous neurogliocytoma in nude mice

.XIAO Wengfeng，LI Jun,HUO Gang,ZHAI Anlin,ZHENG lvping.Department Of Neurosurgery,The Second Affiliated Hospital Of North Sichuan Medical College，NO.56 YueJin Road，Mianyang 621000, China.Tel:08162348021.

ObjectiveTo explore the effects of high intensity focused ultrasound(HIFU)on cell multiplication

Neurogliocytoma High Intensity Focused Ultrasound Cell Multiplication Apoptosis

R739.410.6

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.07.007

2015-01-13）

* 川北醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科（綿陽(yáng)621000）