黃芩湯抗TNBS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎活性研究

巢　蕾，曹雨誕，陳佩東

(1.江蘇省中醫(yī)院藥劑科,江蘇 南京　210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京　210046)

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黃芩湯抗TNBS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎活性研究

巢蕾1，曹雨誕2，陳佩東2

(1.江蘇省中醫(yī)院藥劑科,江蘇 南京210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京210046)

摘要：目的 研究黃芩湯水煎液中主要成分及對(duì)2,4,6-三硝基苯磺酸鈉 (TNBS)造模balb/c小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎的作用。方法HPLC-MS法分析水煎液成分。雄性balb/c 小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，TNBS模型組，柳氮磺嘧啶陽(yáng)性對(duì)照組(500 mg·kg-1)，黃芩湯水煎液1，2，4 g·kg-1治療組。TNBS造模7 d后，研究各組小鼠的結(jié)腸病理評(píng)分、微觀評(píng)分、體質(zhì)量、小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和血清髓過(guò)氧化物酶(MPO)。結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，黃芩湯水煎液中含有復(fù)方中主要成分，黃芩湯水煎液可使TNBS造模balb/c小鼠的體質(zhì)量明顯增加，改善身體的一般狀況和小鼠結(jié)腸黏膜的損傷，下調(diào)MPO。結(jié)論黃芩湯水煎液中含有各藥物的主要成分，對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有較好的治療作用。

關(guān)鍵詞：潰瘍性結(jié)腸炎;黃芩湯;髓過(guò)氧化物酶;液質(zhì)聯(lián)用;2,4,6-三硝基苯磺酸鈉

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種常見(jiàn)的非透壁性腸道炎癥[1]，盡管目前其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但一般認(rèn)為是由于腸道細(xì)菌過(guò)度活躍引發(fā)的黏膜免疫反應(yīng)所引起的疾病[2]。黃芩湯由黃芩、炙甘草、白芍和大棗組成，臨床主要治療腹瀉、嘔吐、惡心等腸道疾病，對(duì)抗癌藥物引起的腸黏膜損傷具有修復(fù)作用[3]。黃芩湯中各藥物主要含有黃酮類(lèi)[4-5]、皂苷類(lèi)[6]、單萜苷類(lèi)[7]和三萜類(lèi)[8]等成分，并且具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用[9-12]。近年對(duì)黃芩湯的抗?jié)冃越Y(jié)腸作用研究有一定進(jìn)展[13-14]，但對(duì)黃芩湯作用的機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚不明確。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芩湯水煎液的化學(xué)成分進(jìn)行了液質(zhì)聯(lián)用分析，并對(duì)其抗2,4,6-三硝基苯磺酸鈉(TNBS)誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的活性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

1材料

1.1藥物和試劑黃芩湯由黃芩、白芍、炙甘草和大棗組成，分別購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古(No.121201)、安徽(No.120809)、山東和河北(No.121126)，由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室吳德康教授鑒定為黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、白芍(PaeonialactifloraPall)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)和大棗(ZiziphusjujubeMill.)。芍藥苷、黃芩苷、齊墩果酸、烏蘇酸、甘草酸購(gòu)自中國(guó)藥品鑒定所，氧化芍藥苷、羥基芍藥苷、白樺脂酸、甘草次酸、甘草查爾酮A、甘草苷、異麥角甾苷、白楊素購(gòu)自成都曼思特公司，漢黃芩素、千層紙素A、黃芩素分離自本實(shí)驗(yàn)室。 TNBS購(gòu)自sigma公司，柳氮磺嘧啶(SASP)，上海三維公司，批號(hào)20130514，戊巴比妥鈉，髓過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒,南京建成公司,批號(hào)20140110。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性balb/c小鼠(20～24 g)，購(gòu)自青龍山動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCIXK(蘇) 2012 -0004。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器1290液相色譜系統(tǒng)，6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)(安捷倫)，數(shù)據(jù)采集和處理應(yīng)用MassHunter 工作站軟件 (Version B.03.00)完成 。

2方法

2.1黃芩湯水煎液的制備黃芩300 g，白芍200 g和炙甘草200 g，大棗300 g[3]，以8倍量水煎煮3次， 每次1 h。所得浸膏得率為32.6%，分別配制成1、2、4 g·kg-1給藥劑量。

2.2HPLC-MS分析條件液相色譜條件為Kromasil C18(250 mm×6 mm,5 μm)色譜柱，柱溫 30℃，流動(dòng)相 A 為0.05%甲酸 ，B為乙腈，梯度洗脫(0～10 min, 85%～80% A; 10～35 min, 80%～75% A;35～55 min, 75%～70% A;55～65 min, 70%～60% A;65～90 min,60%～35%A;90～92.5 min,35%～5% A;92.5～102.5 min,5%A;102.5～110 min,5%～85%A;110～115 min, 85%A)；體積流量0.6 mL·min-1，進(jìn)樣3 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，負(fù)離子模式掃描；干燥氣溫度350℃，干燥氣流量10 L·min-1，離子源溫度320℃，霧化氣電壓40 psi(1 psi=6.895×103Pa)，毛細(xì)管電壓3 500 V。

2.3動(dòng)物分組與給藥小鼠飼養(yǎng)溫度22～24℃，隨機(jī)分為6組 (n=10)，分別為空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，TNBS模型組。給藥組為黃芩湯水煎液1、2、4 g·kg-1劑量組。小鼠禁食24 h后，以戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉，通過(guò)0.56 mm PE管將三硝基苯磺酸鈉100 mg·kg-1注入小鼠結(jié)腸4 cm處造模。50%TNBS試劑0.1 mL 緩慢注入小鼠結(jié)腸，空白組注入50%乙醇。然后將小鼠垂直倒立，保持2～3 min，放回鼠籠[15]。空白對(duì)照組及模型組以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)給藥，陽(yáng)性對(duì)照組以柳氮磺嘧啶(500 mg·kg-1)給藥，給藥組為黃芩湯水煎液1、2、4 g·kg-1，持續(xù)7 d。

2.4樣品采集造模7 d后，小鼠眼眶取血，然后處死。將小鼠腹膜剪開(kāi)，取距肛門(mén)2 cm以上3～5 cm處結(jié)腸，以PBS液反復(fù)清洗，置于濾紙上吸干水分。取相同位置結(jié)腸，在10%福爾馬林中固定24 h，用于病理切片。所取血液放置5 min后，3 000 r·min-1離心,取出血清后置于PE管，-80℃保存。

2.5結(jié)腸病理和組織學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)TNBS誘導(dǎo)的炎癥損傷進(jìn)行結(jié)腸病理評(píng)價(jià)：0級(jí)，沒(méi)有損傷;1級(jí)，水腫，沒(méi)有潰瘍；2級(jí)，輕微潰瘍，沒(méi)有明顯炎癥；3級(jí)，潰瘍伴有1處炎癥；4級(jí)，2處或以上炎癥伴有潰瘍面積小于1 cm；5級(jí)，2處以上嚴(yán)重潰瘍或大于1 cm炎癥區(qū)域。結(jié)腸組織以4%多聚甲醛固定，脫水，隨后嵌入石蠟，進(jìn)行HE染色組織學(xué)評(píng)價(jià)：0級(jí)，正常結(jié)腸;1級(jí)，黏膜炎癥；2級(jí)，炎癥病灶于黏膜表層或下層；3級(jí)，病灶于肌層；4級(jí)，病灶位于絨毛膜；5級(jí)，嚴(yán)重潰瘍和炎癥[15]。

2.6髓過(guò)氧物酶評(píng)價(jià)小鼠血清MPO活力以spectrophotometer (Bio-Bad, USA)測(cè)定，波長(zhǎng)460 nm ，按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行測(cè)定[16-17]。

3結(jié)果

3.1黃芩湯水煎液HPLC-MS分析黃芩湯水煎液總離子流圖見(jiàn)圖1，其中A為混和對(duì)照品，B為黃芩湯水煎液。從分析結(jié)果可以看出，黃芩湯樣品中含有包括黃芩中的黃芩苷等主要黃酮類(lèi)成分，白芍中的芍藥苷等單萜苷類(lèi)成分，炙甘草中的甘草酸等三萜及黃酮類(lèi)成分及大棗中的白樺脂酸等三萜類(lèi)成分。

A混合對(duì)照品B黃芩水煎液樣品

圖1黃芩湯水煎液總離子流圖

注：1.氧化芍藥苷；2.羥基芍藥苷；3.芍藥苷；4.異麥角甾苷；5.甘草苷；6.麥角甾苷；7.黃芩苷；8.甘草素；9.黃芩素；10.甘草酸；11.千層紙素A；12.白楊素；13.漢黃芩素；14.甘草查爾酮A；15.甘草次酸；16.烏蘇酸；17.白樺脂酸；18.齊墩果酸。

表1　黃芩湯對(duì)TNBS造模小鼠結(jié)腸病理評(píng)分、體質(zhì)量、結(jié)腸和MPO的影響

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較#P<0.05，▲P<0.01。

3.2病理學(xué)觀察及損傷評(píng)分造模后，各組的體質(zhì)量變化、結(jié)腸長(zhǎng)度、宏觀損傷評(píng)分和MPO結(jié)果見(jiàn)表1。

小鼠經(jīng)TNBS造模后出現(xiàn)皮毛疏散、進(jìn)食減少、懶動(dòng)、腹瀉和便血等癥狀。小鼠體質(zhì)量下降明顯，結(jié)腸部位表現(xiàn)出不同程度的紅腫和潰瘍。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。由此可以看出，模型組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度為(5.98±0.30)cm，而體質(zhì)量下降(-19.23 ±2.15)%，與對(duì)照組比較明顯下降。結(jié)腸病理評(píng)分和血清MPO活力則顯著上升，與對(duì)照組比較均有顯著性差異，表明造模成功。經(jīng)過(guò)柳氮磺嘧啶和黃芩湯治療后，結(jié)腸長(zhǎng)度和體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯，而結(jié)腸病理評(píng)分和MPO活力則顯著下降，與模型組相比較均有顯著性差異，表明對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎有治療作用，且黃芩湯三個(gè)劑量組呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

3.3組織學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)造模小鼠結(jié)腸組織的HE染色組織學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組有黏膜的輕微浸潤(rùn)，空白組有正常上皮的黏膜，模型組顯示了黏膜有炎性浸潤(rùn)并且伴有嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)扭曲，竇炎和隱窩膿腫，藥物治療組表明局部灶腺腔有凋亡細(xì)胞，但比模型組有較大改善,見(jiàn)圖2。

4討論

黃芩湯中主要成分具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用。應(yīng)用三硝基苯磺酸鈉法制備的UC大鼠模型是探討UC發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制和研究開(kāi)發(fā)UC新藥的一個(gè)理想模型，本實(shí)驗(yàn)選擇TNBS模型造模。

通過(guò)HPLC-MS可以看出，黃芩湯水煎液中保留了各藥物中主要活性成分，其中黃芩中的黃芩苷、白芍中的芍藥苷、甘草中的甘草酸和大棗中的三萜苷元白樺脂酸等都存在于水煎液中。這些成分都具有調(diào)節(jié)免疫和抗菌、抗炎的作用,其中的黃芩苷、甘草酸等也是黃芩湯血清中的主要成分[18]。

造模后小鼠的結(jié)腸明顯縮短，體質(zhì)量下降明顯，有便血、懶動(dòng)等癥狀，而MPO活力顯著增加是體內(nèi)炎癥的重要表現(xiàn)[19]。陽(yáng)性對(duì)照組和各給藥組與模型組相比，結(jié)腸長(zhǎng)度顯著增加，體質(zhì)量恢復(fù)明顯，MPO活力下降，結(jié)腸損傷恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩湯水煎液對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有較好的治療作用，且呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

目前，全球治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物有100余種，而正在研究的藥物多達(dá)近80種，包括水楊酸類(lèi)藥物如美沙拉嗪，腫瘤壞死因子拮抗劑如戈利木單抗，免疫抑制劑如芬戈莫德、山喜多 ，干細(xì)胞療法藥物如remestemcel-I，但這些藥物停藥后容易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期應(yīng)用副作用大。黃芩湯出自《傷寒論》，是“醫(yī)圣”張仲景傳世的“經(jīng)方”之一，本實(shí)驗(yàn)研究了黃芩湯水煎液所含成分及其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎作用，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供了依據(jù)。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.012

基金項(xiàng)目：南京中醫(yī)藥大學(xué)風(fēng)險(xiǎn)基金(No CX201202)

通信作者：陳佩東，男，博士，副教授，研究方向：中藥化學(xué)及活性成分研究, E-mail:chenpeidong1970 @163.com

(收稿日期:2015-08-20,修回日期:2015-09-04)

Effect of huangqin decoction on TNBS induced ulcerative colitis in mice

CHAO Lei1,CAO Yu-dan2, CHEN Pei-dong2

(1.JiangsuHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;

2.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the main constituents and the effects of Huangqin decoction on 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) induced colitis in mice. Methods The decoction was analyzed by HPLC-MS, and the animals were randomly divided into 6 groups(n=10):normal control, TNBS control, positive control(500 mg·kg-1) and Huangqin decoction groups with 1,2,4 g·kg-1respectively. 7 days after the induction of colitis with TNBS, the effects were studied by pathological score, histological analysis, body loss, colon length as well as by determination of MPO.Results The decoction had the main compounds of the plants. After the treatment with the decoction, the body weight and colon length were increased, the microscopic and macroscopic score were lowered, and the level of serum MPO activity was markedly decreased. Conclusion Hangqin decoction has the main constituents from various plants, and is effective in the treatment of colitis induced by TNBS.

Key words：ulcerative colitis；huangqin decoction;MPO;HPLC/MS;2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid