活犀角與犀角抗驚厥作用的研究

馮潤(rùn)東,曹　蕾,劉　蕊,宋冰雪，劉　靜，曹永孝

(1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安　710065;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 陜西 西安　710061)

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活犀角與犀角抗驚厥作用的研究

馮潤(rùn)東1,曹蕾2,劉蕊2,宋冰雪2，劉靜2，曹永孝2

(1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安710065;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 陜西 西安710061)

摘要：目的通過(guò)研究活犀角與犀角對(duì)小鼠的抗驚厥作用，探討活犀角是否可以作為犀角的代用品。方法隨機(jī)將280 只小鼠(自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)160只，抗驚厥實(shí)驗(yàn)120只),分為活犀角與犀角各4個(gè)劑量組(700、350、175、90 mg·kg-1)，另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)地西泮片陽(yáng)性對(duì)照組，分別灌胃給予對(duì)應(yīng)劑量的試驗(yàn)樣品，連續(xù)2 d。末次給藥后30 min后用自主活動(dòng)記錄儀記錄各組20只小鼠自主活動(dòng)；同時(shí)對(duì)各組另外15只小鼠采用尼可剎米誘發(fā)動(dòng)物驚厥，記錄小鼠出現(xiàn)驚厥的時(shí)間和死亡時(shí)間。結(jié)果自主活動(dòng)記錄結(jié)果顯示，4個(gè)劑量的活犀角和犀角對(duì)小鼠均有興奮作用；抗驚厥結(jié)果顯示活犀角700、350、175、90 mg·kg-1和犀角350、175、90 mg·kg-1能明顯降低小鼠的驚厥發(fā)生率和/或死亡率，且在350、175、90 mg·kg-1劑量下活犀角和犀角對(duì)小鼠的抗驚厥作用無(wú)顯著性差異。結(jié)論 在該驗(yàn)條件下，在抗驚厥作用方面可初步判斷活犀角在350、175、90 mg·kg-1劑量可以作為犀角的代用品進(jìn)行使用。

關(guān)鍵詞：活犀角；犀角；抗驚厥；小鼠

犀角又名犀牛角，來(lái)源于犀科動(dòng)物角質(zhì)的角，位于犀牛面鼻骨部正中央的獸角，由角質(zhì)細(xì)胞組成的有機(jī)質(zhì)地物質(zhì)，屬皮膚衍化物的組織。其物質(zhì)成分起始于毛發(fā)，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)、硬化而成，角內(nèi)含角蛋白及膽固醇、磷酸鈣、碳酸鈣、酪氨酸，還含有其他蛋白質(zhì)、肽類、游離氨基酸、胍衍生物、甾醇類等成分。犀牛角呈圓錐形，自底部向上漸細(xì)，稍彎曲，長(zhǎng)短不等[1]，具有清熱、涼血、定驚、解毒、治傷寒溫疫熱入血分、驚狂、煩躁、譫妄、斑疹、發(fā)黃、吐血、衄血、下血、痛疽腫毒等功效；是我國(guó)特有的一類動(dòng)物來(lái)源的名貴中藥，具有活性強(qiáng)、療效顯著、副作用小等特點(diǎn)。近代研究證明犀角在鎮(zhèn)靜安神、抗驚厥、對(duì)抗、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)[2]、抗炎[3]等方面有較好的療效，但犀角作為珍貴的中藥材，價(jià)格昂貴。且隨著犀牛獵捕增加，棲息地的消失和種群的分離，犀牛數(shù)量日益減少。作為中藥材原料的野生犀牛角更是罕見。為了挽救面臨絕種的犀牛，白犀牛和亞洲犀牛在1973年，黑犀牛在1977年都被列入《國(guó)際野生物貿(mào)易公約(CITES)》附錄一中，這些行動(dòng)終結(jié)了對(duì)犀牛的合法交易。且由于保護(hù)野生動(dòng)物保護(hù)法規(guī)的執(zhí)行，犀角已在臨床禁用， 目前多用水牛角替代犀牛角作為中藥材的使用。因此，尋找一種療效確切、來(lái)源易得的犀角替代品，對(duì)于保護(hù)野生動(dòng)物及推動(dòng)中醫(yī)藥的發(fā)展有著重要的作用。本文主要研究活犀角的抗驚厥作用，并與犀角進(jìn)行了對(duì)比研究[4]。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物和試劑活犀角粉和犀角塊均由龍輝藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)分別為080101-ZB和080501-ZB。阿司匹林，SIGMA公司，批號(hào)107K0101。地西泮片，山東平原制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)060302，國(guó)藥準(zhǔn)字H37023039；尼可剎米，北京市藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)07070224，國(guó)藥準(zhǔn)字H11020553。

1.2動(dòng)物280只雄性18～22 g昆明種小鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(陜)2007-003，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%)。

1.3儀器YLS-1A型多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備維修供應(yīng)站： AL104型電子分析天平(瑞士Mettior Toiedo)。

2方法

2.1對(duì)自主活動(dòng)的影響的觀測(cè)取160只小鼠，隨機(jī)分為8組，每組20只：(1)對(duì)照組; (2)地西泮 2.5 mg·kg-1組; (3)～(5)活犀角 700、350、175 mg·kg-1組；(6)～(8)犀角700、350、175 mg·kg-1組。用自主活動(dòng)記錄儀記錄小鼠自主活動(dòng)：自主活動(dòng)記錄儀共有5個(gè)記錄盒, 每盒每次放1只小鼠，記錄30 min小鼠的活動(dòng)次數(shù)。計(jì)數(shù)期間保持室內(nèi)安靜。各組小鼠ig給藥，20 mL·kg-1，每日1次，連續(xù)2 d。末次給藥后30 min, 再次記錄小鼠30 min內(nèi)自主活動(dòng)，進(jìn)行組間比較[5-11]。

2.2抗驚厥作用的觀測(cè)取小鼠120只，按隨機(jī)分為8組, 每組15只：(1)對(duì)照組; (2)地西泮2.5 mg·kg-1組;(3)～(5)活犀角700、350、175 mg·kg-1組；(6)～(8)犀角700、350、175 mg·kg-1組。各組均按20 mL·kg-1ig給藥,每日1次, 連續(xù)2 d。末次給藥30 min, ip尼可剎米350 mg·kg-1誘發(fā)驚厥，尼可剎米后立即秒表計(jì)時(shí)，記錄小鼠出現(xiàn)驚厥的時(shí)間、死亡時(shí)間。計(jì)算驚厥潛伏期、死亡潛伏期、驚厥發(fā)生率和死亡率。未驚厥小鼠潛伏期按10 min計(jì)，未死亡小鼠死亡潛伏期按2 h計(jì)[12-14]。驚厥以小鼠發(fā)生強(qiáng)直性跳躍為指標(biāo),驚厥的潛伏期為從給尼可剎米開始到小鼠第一次出現(xiàn)驚厥的時(shí)間, 死亡時(shí)間為從給尼可剎米開始到死亡的時(shí)間[15-17]。

3結(jié)果

3.1對(duì)自主活動(dòng)的影響表1結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，地西泮組小鼠的自主活動(dòng)明顯降低，活犀角和犀角的自主活動(dòng)明顯升高；活犀角組與犀角組比較，自主活動(dòng)都明顯升高，且結(jié)果相似[21-24]。見圖1。

3.2抗驚厥作用由表2可以看到由尼可剎米誘發(fā)的小鼠驚厥，在地西泮組、活犀角組和犀角組驚厥率、死亡率都有明顯下降，活犀角組降低驚厥率死亡率的效果與灌胃劑量成正相關(guān)。犀角組在700 mg·kg-1時(shí)相較對(duì)照組驚厥率、死亡率沒有顯著差異，而其余劑量組則有顯著下降。但是各組驚厥潛伏期和死亡潛伏期偏差較大，多數(shù)未見顯著性差異[25-27]。

表1　 活犀角對(duì)小鼠自主活動(dòng)的作用

注：同劑量活犀角與犀角組比較**P<0.05，*P<0.01。

表2　活犀角對(duì)抗小鼠尼可剎米驚厥的作用

注：同劑量活犀角與犀角組比較**P<0.05，*P<0.01。

由于活犀角、犀角175 mg·kg-1仍能明顯降低尼可剎米驚厥小鼠的死亡率，推測(cè)這不是其最小有效劑量。為了探索其最小有效劑量，另取小鼠60只，分為：對(duì)照組，活犀角、犀角90 mg·kg-1組，同法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，表3、4結(jié)果顯示，活犀角、犀角90 mg·kg-1的小鼠的驚厥率和/或死亡率仍明顯低于對(duì)照組[28-29]。再取小鼠60只，分為：對(duì)照組，活犀角、犀角45 mg·kg-1組，再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示活犀角、犀角45 mg·kg-1組的驚厥率和死亡率與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異[30]。

表3　90 mg·kg-1劑量活犀角對(duì)抗小鼠尼可剎米驚厥的作用

注：活犀角與犀角組比較**P<0.05。

表4　 45 mg·kg-1劑量活犀角對(duì)抗小鼠尼可剎米驚厥的作用

注：活犀角與犀角組比較**P<0.05，*P<0.01。

4討論

結(jié)果提示，活犀角和犀角均具有抗驚厥作用，從小鼠自主活動(dòng)記錄儀測(cè)定結(jié)果可以看出，各組的標(biāo)準(zhǔn)差仍較大。由于犀角有鎮(zhèn)靜作用，我們預(yù)計(jì)其自主活動(dòng)會(huì)減少，因而選地西泮作對(duì)照[31]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地西泮有減少自主活動(dòng)的趨勢(shì)，但與對(duì)照組沒有顯著差異，而犀角和活犀角組的自主活動(dòng)明顯高于對(duì)照組[32]。這一結(jié)果提示，活犀角、犀角可能對(duì)正常小鼠有興奮作用。但值得一提的小鼠和人對(duì)鎮(zhèn)靜劑的反應(yīng)可能不同，我們也曾記錄過(guò)小鼠用小劑量的地西泮和戊巴比妥鈉時(shí)小鼠出現(xiàn)自主活動(dòng)增多，而不是降低的現(xiàn)象[33]。我們?cè)噲D用咖啡因興奮小鼠，觀察受試藥對(duì)咖啡因興奮小鼠的作用，但由于用了咖啡因后小鼠表現(xiàn)為明顯的撓頭動(dòng)作，雖然也屬自主活動(dòng)，但并不能被自主活動(dòng)記錄儀記錄，因此測(cè)定自主活動(dòng)的方法還有待改進(jìn)。

尼可剎米誘發(fā)小鼠驚厥是目前比較常用的一種造驚厥模型的方法。地西泮能明顯降低小鼠的驚厥發(fā)生率和死亡率[34]?；钕?00、350、175 mg·kg-1和犀角350和175 mg·kg-1能明顯降低驚厥的發(fā)生率和/或死亡率。由于175 mg·kg-1的作用仍較明顯，推測(cè)這不是其最小有效劑量[35]。為了探索其最小有效劑量，兩次降低劑量后發(fā)現(xiàn)活犀角和犀角90 mg·kg-1仍能降低驚厥的發(fā)生率和死亡率。而45 mg·kg-1無(wú)明顯作用[14]。結(jié)果提示，活犀角和犀角的抗驚厥作用突出，活犀角的在抗驚厥作用方面可以替代犀角使用。

由于野生動(dòng)物保護(hù)法的執(zhí)行，傳統(tǒng)中藥材犀角已禁止在臨床上使用，珍稀中藥材的的使用一直“做減法”。通過(guò)“活體刮角”技術(shù)從活體犀牛上獲得活犀角，即完成珍稀藥材的獲取，又保護(hù)了野生動(dòng)物，是中藥可持續(xù)發(fā)展的有利因素。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)全面比對(duì)了活犀角和犀角的藥效學(xué)，并探討了其機(jī)制，為活犀角進(jìn)一步的臨床研究建立了良好的基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)活犀角藥效和安全性的研究，這將為廣大患者提供更好的選擇。

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通信作者：曹永孝，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：43474735@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.010

(收稿日期：2015-07-21，修回日期：2015-09-28)

A Study of the Anticonvulsive Effects Between Living Rhino
Horn and Rhino Horn

FENG Run-dong1，CAO Lei2， LIU Rui2，et al

(1.ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl,Shaanxi，Xi’an710065;

2.Xi’anJiaotongUniversityCollegeofMedicine,Shaangxi，Xi’an710061)

Abstract：ObjectiveTo study of the anticonvulsive effects between living Rhino Horn and Rhino Horn and to explore whether living Rhino Horn could be used as a substitute of Rhino Horn. Methods The 280 mice were randomly divided into four groups of living Rhino Horn (700、350、175、90 mg·kg-1), four groups of Rhino Horn (700、350、175、90 mg·kg-1)，a blank control group and a positive group of diazepam. The mice were gavaged with the corresponding dose of test sample for 2 consecutive days. Thirty minutes after last gavaged，the autonomic activeties of 20 mice in every group were records by the independent event recorder. The other 15 mice in every group were induced convulsion by Nikethamide. And then, it was recorded that the time of convulsion and the time of death of the mice. Results Independent activities and anticonvulsants, according to the results of Rhino Horn, living Rhino Horn could be have excitation on the mice of blank control group. Live Rhino Horn (700、350、175、90 mg·kg-1)and Rhino Horn (350、175、90 mg·kg-1)could significantly reduce the incidence of eclampsia and/or mortality of the mice, and there was no significant difference between live Rhino Horn and Rhino Horn with the same dose (350、175、90 mg·kg-1). Conclusion Under the condition of this experiment，It was estimated preliminarily that the anticonvulsive effect of living Rhino Horn at a dosage of 350、175、90 mg·kg-1was equal to the anticonvulsive effect of the traditional Rhino Horn, and then the living Rhino Horn could be used as a substitute of Rhino Horn.

Key words：livingRhino Horn;Rhino Horn;anticonvulsive effect;mice