基于“通腎絡(luò)、益脾腎”治法研究足細(xì)胞凋亡及自噬*

范增慧，馬鋒鋒，李小會(huì)，陳麗名，谷浩榮

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽(yáng) 712046）

糖尿病腎?。―N）發(fā)病率逐年上升，伴隨病程進(jìn)展導(dǎo)致的終末期腎衰往往是該病的結(jié)局。DN患者無論病情輕重大多存在蛋白尿的臨床癥狀，蛋白尿的產(chǎn)生、發(fā)展及腎小球硬化程度與足細(xì)胞數(shù)目減少和密度降低密切相關(guān)。足細(xì)胞終末分化的特性決定其損傷丟失后幾乎不可再生，作為腎小球?yàn)V過膜的關(guān)鍵屏障，高糖導(dǎo)致的足細(xì)胞凋亡會(huì)直接影響及細(xì)胞毛細(xì)血管壁的選擇通透性加重腎損傷，因此成為DN發(fā)生發(fā)展的最主要受累靶細(xì)胞。細(xì)胞凋亡是足細(xì)胞損傷丟失的主要原因，而自噬可能是細(xì)胞自體減少凋亡發(fā)揮自身保護(hù)作用的主要機(jī)制。細(xì)胞自噬具有雙面調(diào)節(jié)性，保護(hù)性及損傷性作用根據(jù)細(xì)胞種屬的不同而不同，研究顯示腎臟中足細(xì)胞的自噬水平較其他細(xì)胞高[1]?；谧允珊图?xì)胞凋亡的關(guān)系，進(jìn)一步探討通絡(luò)益腎方能否通過啟動(dòng)自噬有效降低體外高糖誘導(dǎo)的小鼠腎足細(xì)胞（MPC-5）凋亡對(duì)腎小球?yàn)V過屏障起保護(hù)作用，使該方在臨床控制DN病情惡化、減少蛋白尿及腎小球硬化程度的分子水平得到印證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 成熟無特定病原體（SPF），SD雄性大鼠40只（許可證號(hào)：SCKK（陜）2017-003，合格編碼：61001700002816），由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量180～220 g。

MPC-5小鼠腎足細(xì)胞株（編號(hào)：BNCC337685，由北納生物科技有限公司提供），增殖結(jié)束后置于37℃恒溫，含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)基由紅變黃后使用胰蛋白酶消化，按照1∶3傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至顯微鏡觀察細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形上皮細(xì)胞樣，有星形樹枝狀突起，符合文獻(xiàn)報(bào)道特征，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑 通絡(luò)益腎方由生地、山茱萸、山藥、茯苓、制附子、澤瀉、水蛭、全蝎、桃仁、酒大黃組成，全部藥材經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供并鑒定，藥材質(zhì)量達(dá)標(biāo)。生藥材按照30∶15∶15∶12∶10∶12∶6∶10∶12∶10 比例，分高、中、低（4.76 g/mL、2.38 g/mL、1.19 g/mL）劑量購(gòu)買所需生藥材。0.9%生理鹽水購(gòu)買于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房。

胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司，SV30087.02）；1640培養(yǎng)基無糖、無HEPES（美國(guó)Hyclone公司，11879020）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，AR0146）；沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3（bcl-2/BNIP3）一抗（美國(guó)Abcam公司，ab189494、ab109362）；Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bax）、P62蛋白（P62）一抗（美國(guó)CST公司，3498S、23214S）；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，CA1020-100T）；羊抗兔二抗100μL（武漢博士德生物工程有限公司，BA1054）；Hoechst33342（北京索萊寶科技有限公司，C0030）。

1.3 主要儀器 尼康倒置光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：SMZ745，上海普赫生物科技有限公司）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：FACS Calibur，美國(guó) BD公司）；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma3111型，美國(guó)Thermo公司）；超凈細(xì)胞工作臺(tái)（型號(hào)：SW-CJ-2FD，蘇凈科學(xué)器材有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 含藥血清制備 成熟SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，隨機(jī)每組10只分為正常組、通絡(luò)益腎方高、中、低劑量組4組。中藥制劑根據(jù)人與大鼠體表面積折算系數(shù)最終按照4.76、2.38、1.19 g/mL藥物濃度分高、中、低劑量。大鼠連續(xù)給藥10 d，每日按2 mL灌胃。正常組取0.9%生理鹽水等劑量灌胃。于末次給藥2 h后，腹主動(dòng)脈取血，血清過濾分裝后-20℃保存待用。

1.4.2 細(xì)胞分組及給藥 將細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇后接種于 9∶1∶0.1（DMEM 培養(yǎng)液∶胎牛血清∶青霉素鏈霉素混合液）比例配制細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)條件培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞分化成熟，倒置顯微鏡觀察大體呈鵝卵石樣形態(tài)，末端有分枝，接種于6孔板中融合至80%～90%，改用含1%胎牛血清培養(yǎng)液使細(xì)胞饑餓6～8 h后分6組加藥干預(yù)。正常組：5.6 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清；高糖組：30 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清；通絡(luò)益腎方高、中、低劑量組：30 mmol/L葡萄糖+10%高、中、低劑量含藥血清組，高滲組：甘露醇24.5 mmol/L+10%正常大鼠血清；細(xì)胞干預(yù)48 h胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.3 Hoechst33342觀察細(xì)胞凋亡 細(xì)胞按照分組依次種于6孔板，密度達(dá)60%～70%，加藥干預(yù)。48 h后PBS清洗掉雜質(zhì)及死細(xì)胞，4%多聚甲醛固定液常溫固定15 min，去除固定液后再次清洗。6孔板每孔加入500 μL Hoechst33342熒光染料，室溫反應(yīng)20 min，封片染色后直接置于熒光顯微下觀察。

1.4.4 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率 Annexin V/PI雙染可以反應(yīng)藥物干預(yù)后的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)從而區(qū)分凋亡早期和晚期細(xì)胞，首先用去離子水按照 9∶1 稀釋 Binding Buffer（10×）備用。15 mL離心管先收集細(xì)胞上清液加貼壁細(xì)胞，混均后800 g離心5 min棄培養(yǎng)基，向上清細(xì)胞和貼壁細(xì)胞混液中各加入500 μL Binding Buffer重懸，移至同一離心管使細(xì)胞密度達(dá)到1×106個(gè)。1.5 mL EP管中吸入100 μL細(xì)胞，先加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，再加入5 μL PI同上反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后加入390 μL PBS，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.4.5 Western Blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白SIRT1、P62及促凋亡蛋白BNIP3、Bax表達(dá) 蛋白樣品提取全程冰上操作，清洗并離心收集細(xì)胞，放入1.5 mL EP管中加入配制好的RIPA裂解液槍頭反復(fù)抽打充分裂解裂解30 min，4℃10 000 g/5 min離心去除氣泡，吸出上清，并計(jì)算量。使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，96孔板設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品BSA、蛋白樣品、純水。計(jì)算出所需BCA工作液的體積配制待用，加入工作液后37℃孵育30 min酶標(biāo)儀定量，最后加入上樣緩沖液，煮沸后-80℃保存待用。根據(jù)蛋白分子量配制相應(yīng)濃度分離膠、濃度膠，蛋白上樣后80 V/30 min，110 V/90 min電泳，然后快速轉(zhuǎn)膜，TBST洗膜3遍每次10 min，封閉2 h，孵一抗，4℃過夜。洗膜后孵二抗，置搖床2 h，ECL顯色。利用Image Pro Plus6軟件凝膠成像分析灰度值，并以β-actin為內(nèi)參計(jì)算各蛋白表達(dá)強(qiáng)度的變化，分析灰度值結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞凋亡率數(shù)據(jù)分析以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與正常組細(xì)胞相比，高糖組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），高滲組細(xì)胞凋亡率無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與高糖組相比，通絡(luò)益腎方中劑量組細(xì)胞凋亡率顯著改善，有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01），通絡(luò)益腎方低劑量組細(xì)胞凋亡率也有所下降（P＜0.05），但改善效果不如中劑量組，通絡(luò)益腎方大劑量組細(xì)胞凋亡率無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表 1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率（%）Fig.1 The apoptosis rate of podocytes detected by flow cytometry（%）

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率（x±s）Tab.1 The apoptosis rate of podocytes detected by flow cytometry（x±s）

2.2 Hoechst33342凋亡染色結(jié)果 Hoechst33342染色圖片可見正常組和高滲組熒光圖片藍(lán)染較淡，細(xì)胞均勻橢圓彌散，細(xì)胞核基本無強(qiáng)熒光點(diǎn)聚集，高糖組細(xì)胞凋亡最多，細(xì)胞核呈團(tuán)塊碎裂，染色質(zhì)皺縮發(fā)出致密或碎塊狀強(qiáng)靛藍(lán)光。通絡(luò)益腎方中劑量組、低劑量組與高糖組相比凋亡細(xì)胞數(shù)量有所下降，中劑量方效果最佳，高劑量組因藥物濃度大對(duì)細(xì)胞有毒性，細(xì)胞足突融合導(dǎo)致細(xì)胞貼附能力下降，熒光圖片顯示細(xì)胞不均勻分布，視野內(nèi)滿布強(qiáng)熒光團(tuán)，呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞典型特征。見圖2。

2.3 足細(xì)胞 SIRT1、BNIP3、P62、Bax蛋白表達(dá) 蛋白印跡結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組SIRT1蛋白表達(dá)下降，BNIP3、P62、Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05或P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與高糖組相比，通絡(luò)益腎方中、低劑量組SIRT1蛋白表達(dá)升高，BNIP3、P62、Bax蛋白表達(dá)下降（P＜0.05或 P＜0.01），說明治療有意義。高劑量組 SIRT1、BNIP3、P62、Bax蛋白表達(dá)未見明顯改變（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2、圖 3。

3 討論

通絡(luò)益腎方治療糖尿病腎病是本實(shí)驗(yàn)室近幾年的重點(diǎn)研究課題，中醫(yī)理論認(rèn)為DN是糖尿病遷延日久耗氣傷陰久則病理產(chǎn)物痰、熱、瘀、毒損脾、腎，耗五臟而形成?；贒N動(dòng)態(tài)變化的病機(jī)基礎(chǔ)，杜雨茂[2]教授總結(jié)多年臨證經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本虛標(biāo)實(shí)，腎虛絡(luò)瘀毒蘊(yùn)貫穿DN始末，針對(duì)這種虛實(shí)并見的復(fù)雜病理特點(diǎn)，立法滋陰溫陽(yáng)，解毒通絡(luò)（通腎絡(luò)、益脾腎），治療上選用腎氣丸、抵當(dāng)湯合方化裁的通絡(luò)益腎方治療。全方組方靈活滋陰助陽(yáng)之中意蘊(yùn)通絡(luò)解毒之效，消補(bǔ)兼施之則適用腎虧陰陽(yáng)兩虛，毒瘀阻絡(luò)證。方中生地、山藥、山茱萸、制附子、澤瀉、茯苓共奏益脾腎之功。腎為水火之臟，《素問》有“腎者主蟄”之說，腎藏精陰陽(yáng)充沛對(duì)其氣化、固攝、封藏職能的正常發(fā)揮，有著舉足輕重的作用，生地滋腎陰，制附子助腎陽(yáng)，陰陽(yáng)兼顧之中鞏固了腎臟封藏功能；山藥、澤瀉、茯苓補(bǔ)脾兼滲濕，補(bǔ)而不滯；山茱萸一能收斂固澀、二與生地配伍益腎陰，六藥配伍能兼顧先后天，先天的職能得以正常發(fā)揮，后天的遺失能迅速回補(bǔ)，減少蛋白尿、水腫癥狀的同時(shí)補(bǔ)益了久病虧耗之體。全蝎、水蛭、大黃、桃仁共施泄?jié)崤哦净鲋Γ察钅I絡(luò)實(shí)邪。本課題前期研究從臨床觀察、動(dòng)物及微觀細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等多角度、全面證實(shí)了該方能減輕患者臨床癥狀、延緩腎小球硬化周期及減少尿蛋白，改善DN大鼠腎臟功能、病理及生化指標(biāo)，分子水平深入探究證實(shí)該方還具有對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制系膜細(xì)胞增殖、凋亡[3-4]、穩(wěn)定足細(xì)胞骨架等作用[5]。前期的研究基礎(chǔ)為本課題的開展奠定了基礎(chǔ)。

圖2 熒光倒置顯微鏡觀察各組足細(xì)胞凋亡及形態(tài)變化（×200）Fig.2 Apoptosis and morphological changes of foot cells observed by fluorescence inversion microscope（×200）

圖3 各組細(xì)胞SIRT1、BNIP3、P62、Bax蛋白/內(nèi)參表達(dá)量水平（x±s）Fig.3 Expression levels of SIRT1,BNIP3,P62 and Bax protein in cells of each group（x±s）

糖尿病腎病足細(xì)胞黏附能力下降、密度、數(shù)量減少和進(jìn)行性功能喪失是導(dǎo)致腎小球?yàn)V過膜通透性改變從而加速蛋白尿發(fā)生發(fā)展的重要因素[6]，高糖導(dǎo)致的凋亡是其丟失的關(guān)鍵。因此保護(hù)足細(xì)胞抑制其凋亡成為該病防護(hù)和治療的切入點(diǎn)。自噬是真核細(xì)胞應(yīng)對(duì)復(fù)雜生理和營(yíng)養(yǎng)缺乏、炎癥刺激、氧化應(yīng)激等病理過程的保護(hù)性防御機(jī)制，基礎(chǔ)水平的自噬可程序性降解受損細(xì)胞器、清理大分子物質(zhì)及錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)為細(xì)胞自我修復(fù)、更新提供原料，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。最初研究認(rèn)為凋亡與自噬是隸屬于程序性細(xì)胞死亡下截然不同的兩種細(xì)胞死亡方式，分別為Ⅰ型和Ⅱ型[7]。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)它們?cè)谀承┩飞弦蚴芄餐牡鞍渍{(diào)節(jié)而存在密切的聯(lián)系。同種病理、生理?xiàng)l件刺下因強(qiáng)度的不同或激發(fā)自噬或啟動(dòng)調(diào)亡[8]。DN時(shí)足細(xì)胞在高糖等因素刺激下，既可通過自噬清除廢棄的蛋白和細(xì)胞器，也可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，在不同時(shí)期，自噬和凋亡的活性可能出現(xiàn)變化。查閱文獻(xiàn)總結(jié)兩者的關(guān)系為以下幾個(gè)方面，位居上游的自噬啟動(dòng)凋亡并影響凋亡的程度[9]。自噬可通過多途徑維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定抑制細(xì)胞凋亡[10]。因自噬具有雙重性，兩者可相互轉(zhuǎn)換，在復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)部或協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞死亡或?qū)ふ艺{(diào)控雙方的穩(wěn)態(tài)平衡[11]。黃貴華等[12]從中醫(yī)理論闡述自噬，稱其為臟腑功能失調(diào)久致機(jī)體正虛邪實(shí)，機(jī)體為維持陰陽(yáng)平衡狀態(tài)的自救方式。因此，深入探究自噬與凋亡關(guān)系在調(diào)節(jié)足細(xì)胞的病理生理過程中有著重要的意義。檢測(cè)技術(shù)及中醫(yī)藥事業(yè)的的迅猛發(fā)展為大家深入研究不同疾病，不同病期綜合防治DN提供了新途徑、新思路[13-14]。

表2 各組足細(xì)胞SIRT1、BNIP3、P62和Bax蛋白/內(nèi)參相對(duì)表達(dá)量水平（x±s）Tab.2 Relative expression levels of SIRT1，P62，BNIP3 and Bax protein/β-actin reference in podocytes of each group（x±s）

自噬標(biāo)志蛋白SIRT1、P62能夠啟動(dòng)自噬恢復(fù)高糖培養(yǎng)的腎臟細(xì)胞內(nèi)部能量穩(wěn)態(tài)重建阻止DN發(fā)生和發(fā)展[15-16]。研究表明其參與DN病理、生理進(jìn)程，通過多途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用可成為防治DN的新靶點(diǎn)[17-18]。BNIP3屬于Bcl-2亞家族，與Bax均被稱為促細(xì)胞凋亡的中心調(diào)控蛋白，在凋亡中的研究比較透徹，近年發(fā)現(xiàn)BNIP3不僅影響凋亡還能激活線粒體自噬[19]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)正常組足細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白SIRT1的表達(dá)量較高，而在高糖刺激下的足細(xì)胞內(nèi)表達(dá)降低，通絡(luò)益腎方含藥血清中、低劑量干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)SIRT1的蛋白表達(dá)量較高糖組增高，說明該方可誘導(dǎo)高糖刺激下的足細(xì)胞自噬，提高自噬水平，保護(hù)細(xì)胞。而BNIP3、P62和Bax蛋白在正常組足細(xì)胞中的蛋白表達(dá)變化與SIRT1完全相反表達(dá)低，高糖刺激下的足細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高，利用中藥中、低劑量含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白BNIP3、Bax和P62蛋白表達(dá)量較高糖組降低。而后又利用流式細(xì)胞儀及熒光染色對(duì)各組足細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中藥含藥血清中、低劑量干預(yù)組足細(xì)胞凋亡率較高糖組有所改善，說明通絡(luò)益腎方中、低劑量含藥血清對(duì)高糖刺激的足細(xì)胞有保護(hù)作用，且小劑量組效果不及中劑量組，印證了該方中醫(yī)治療DN的有效性及發(fā)揮作用的機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)中Western blot結(jié)果顯示 BNIP3/β-actin 和 Bax/β-actin在高糖組細(xì)胞中表達(dá)量為（0.64±0.04）和（1.29±0.03），在高劑量組為（0.65±0.04）、（1.33±0.11），與高糖組相比，統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白在高劑量組中表達(dá)未下降，自噬標(biāo)志蛋白SIRT1、P62變化也不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示高糖組足細(xì)胞凋亡率為19.03%，高劑量組為18.55%，高劑量含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞凋亡率未能改善。結(jié)果證實(shí)高劑量含藥血清不能通過改變自噬降低足細(xì)胞凋亡率，保護(hù)足細(xì)胞，延緩死亡。

目前的研究?jī)H證明通絡(luò)益腎方能夠調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬、凋亡的代表性蛋白，升高或降低其表達(dá)，保護(hù)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞，減少其凋亡率，但并不能在分子機(jī)制上確切證實(shí)其因果關(guān)系。高劑量組含藥血清對(duì)足細(xì)胞凋亡率未改善，與高糖組相比不能升高或降低自噬標(biāo)志蛋白SIRT1、P62及促凋亡蛋白BNIP3、Bax表達(dá)，可能與該方中解毒通絡(luò)藥物桃仁、酒大黃、水蛭、全蝎的使用有關(guān)，后期將對(duì)該方進(jìn)行拆解，探究是否與解毒通絡(luò)藥物的使用有關(guān)。后續(xù)將對(duì)本課題進(jìn)行更加深入的研究，基于自噬的某一條經(jīng)典通路，利用基因敲除技術(shù)，敲除或降低自噬關(guān)鍵蛋白或因子，探討通絡(luò)益腎方是否仍能保護(hù)足細(xì)胞，降低凋亡率。并將該方與西藥組作對(duì)比，比較治療效果，進(jìn)一步為DN的中醫(yī)診療提供依據(jù)，明確通絡(luò)益腎方治療DN的確切機(jī)制。