順鉑作用于人惡性睪丸生殖細胞瘤NT2細胞后對腫瘤干細胞標志物的影響

莫艷秀,陳淑娟,范云鵬,李木蘭,張 鵬,劉文彬,肖亞梅*

（1.湘南學院基礎醫(yī)學院,中國湖南郴州423000;2.省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室,中國湖南長沙410081;3.湖南師范大學生命科學學院,中國湖南長沙410081）

人惡性睪丸生殖細胞瘤是最常見的睪丸惡性腫瘤,在男性惡性腫瘤中占1%～2%左右,其惡性程度高,近年來發(fā)病率有持續(xù)上升的趨勢,多好發(fā)于15～35歲[1]。目前,睪丸癌治療中面臨的最大問題是患者經(jīng)過藥物化療之后,l成不良預后,容易引起不育等副作用,嚴重影響了病人的生活質(zhì)量[2]。在惡性睪丸生殖細胞瘤臨床治療中,順鉑（cisplatin,CDDP）作為經(jīng)典的一線化療藥物,引起耐藥是l成腫瘤細胞化療失敗的主要原因。因此,探索化療耐藥形成原因并尋找相應的防治方法,對于深入理解腫瘤患者化療耐受的根本原因以及實現(xiàn)人惡性睪丸生殖細胞瘤的治療有著重要的意義。

腫瘤組織中通常存在著少量具有自我更新和多向分化潛能生物特性的細胞,這類細胞具有無限增生的潛在能力,在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲、復發(fā)和耐藥中具有重要的作用,被稱為腫瘤干細胞（cancer stem cells,CSCs）[3～5]。新近研究發(fā)現(xiàn),胚胎樣干性基因Sox-2、Oct-4和Nanog在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達,在腫瘤干細胞的干性維持中發(fā)揮著關鍵作用,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥性密切相關[6～8]。相關研究顯示CSCs的耐藥機制與ATP結(jié)合盒G超家族成員2（ATP-binding cassette superfamily G member 2,ABCG2）的異常表達也有關[9]。ABCG2是目前研究常用的腫瘤干細胞耐藥靶標,它能使許多藥物對腫瘤干細胞的殺傷作用明顯減弱[10]。隨著研究的進一步深入,人們發(fā)現(xiàn)化療藥物引起腫瘤的耐藥性與耐藥基因的表達和腫瘤干細胞啟動腫瘤形成、生長有密切關系[11]。如何減少惡性睪丸生殖細胞瘤的耐藥性,提高化療效果,成為臨床值得研究的課題。盡管許多研究對惡性睪丸生殖細胞瘤細胞增殖周期分子調(diào)控機制和藥物治療等方面進行了細致的探討[12,13],但腫瘤干性基因在NT2細胞中的具體表達狀況與順鉑引起的耐藥是否有關目前尚無相關報道。

為確定CSCs是否參與了人惡性睪丸生殖細胞瘤對CDDP的耐藥過程,本研究以人惡性睪丸畸胎瘤細胞系NTERA-2（embryonal carcinoma cells,NT2）為研究對象,用20μmol/L順鉑誘導NT2細胞（12 h、24 h、48 h）,通過免疫熒光染色、real-time PCR和Western-blot方法檢測睪丸畸胎瘤干細胞標志性基因Sox-2、Oct-4和Nanog的表達及變化規(guī)律,同時對腫瘤干細胞耐藥分子靶標ABCG2進行real-time PCR檢測,初步探討順鉑對人惡性睪丸生殖細胞瘤NT2細胞的影響與其干細胞特性的關系,為解決臨床生殖細胞瘤治療過程中高轉(zhuǎn)移率和高復發(fā)率等問題提供一定的理論基礎。

1 材料及方法

1.1 主要試劑及細胞來源

NT2細胞由湖南師范大學生命科學學院周暢老師惠贈。順鉑購自山東齊魯制藥有限公司。Sox-2、Oct-4和Nanog抗體購自長沙賽晶生物技術有限公司,β-actin兔抗購于美國Protein technology公司,標記的山羊抗兔和抗鼠IgG熒光二抗購自北京博奧森生物技術有限公司。Total RNA提取試劑盒E.Z.N.A.TM Total RNA Kit域購于美國Omega公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司,目的基因和內(nèi)參基因引物購于湖南擎科生物技術有限公司。BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒和SDSPAGE凝膠配置試劑盒購于美國Biotime公司,RIPA裂解液、增強型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購于長沙維世爾生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

以DMEM（美國Gibco公司）為基礎培養(yǎng)基,同時加胎牛血清（fatal bovine serum,FBS,PAA公司）提供營養(yǎng),具體的成分比例為90%DMEM+9%FBS+1%青鏈雙抗。細胞傳代時,NT2細胞均經(jīng)過0.25%胰酶（trypsin-EDTA）消化2～3 min。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 相差顯微鏡觀察

基于預實驗的結(jié)果并參考文獻[13],將順鉑處理NT2細胞的濃度確定為20μmol/L。順鉑配制:10 mL無菌PBS稀釋順鉑（每支10 mg）后,一次性過濾器過濾除菌,然后用無菌PBS稀釋成濃度為100μmol/L的母液。用CDDP分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后在相差顯微鏡下觀察NT2細胞形態(tài)變化并拍照。

1.4 免疫熒光染色法

將處于對數(shù)生長期的NT2細胞接種至3.5 cm的玻底培養(yǎng)皿中,每孔5×104個細胞,用20μmol/L的CDDP培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h,隨后4%多聚甲醛固定20 min,2%BSA封閉,0.3%Triton通透,Sox-2、Oct-4和Nanog一抗（1︰200）孵育過夜（4 ℃）,Sox-2和Nanog抗兔二抗（1︰500）以及Oct-4抗鼠二抗（1︰500）避光孵育1 h（37℃）,DAPI染核后防猝滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞Sox-2、Oct-4和Nanog的表達量并對結(jié)果進行分析[14]。

1.5 RNA提取以及實時熒光定量PCR

將細胞制成細胞懸液,以1×106個細胞數(shù)接種于10 cm的細胞培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液,選取20μmol/L的CDDP進行孵育處理,時間分別為12 h、24 h、48 h。按照試劑盒說明提取RNA,再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系20μL,然后將反轉(zhuǎn)錄體系稀釋10倍。RT-PCR反應體系為10μL,包括:2×PCR master mix 5μL;正反向引物工作液各0.5μL;cDNA模板1μL;無菌水3μL。每個樣品設3個復孔。PCR反應條件:50℃2 min;95℃預變性10 min;95℃15 s,60℃1 min,40個循環(huán)。反應在ABI 7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行。目的基因的定量表達通過與內(nèi)參基因β-actin比較進行分析[15]。相關引物序列見表1。

1.6 Western-blot檢測

將對數(shù)生長期的NT2細胞制成細胞懸液,以1×106細胞數(shù)接種于24孔的細胞培養(yǎng)板中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液,用20 μmol/L CDDP 分別培養(yǎng) 12 h、24 h、48 h后用RIPA細胞裂解液處理,12 000 r/min 4℃離心20 min,取上清,用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定總蛋白質(zhì)濃度,隨后將蛋白質(zhì)分裝保存于-80℃冰箱。細胞裂解液經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后,用硝化纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜后進行免疫印跡,5%脫脂奶粉封閉2 h,4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。辣根過氧化酶標記的二抗孵育1 h后,用ECL超敏化學發(fā)光液顯色曝光。使用Bio-Rad Quantity One軟件對目的條帶進行圖像分析,測定灰度值,用β-actin作為內(nèi)參來表示各組相對表達量且每組結(jié)果重復3次[16]。以上Western-blot各個步驟均按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒標準流程進行操作（蛋白質(zhì)上樣量均為50μg）。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理,用Adobe Illustrator Cs 5計算機軟件制圖。計量資料以均值±標準差（x±s）表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CDDP對NT2細胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示:對照組NT2細胞呈短梭形,細胞生長旺盛,細胞輪廓清晰且貼壁良好,呈匯合生長（圖1A）,傳代約1～2 d;20μmol/L CDDP 處理（12 h、24 h、48 h）后的 NT2 細胞隨著處理時間增加,細胞變2,漂浮數(shù)量增多,活細胞數(shù)量明顯減少,但仍有部分細胞可繼續(xù)存活（圖1B～D）。

2.2 免疫熒光技術檢測Sox-2、Oct-4和Nanog在NT2細胞中的表達與定位

用免疫熒光法檢測NT2細胞中腫瘤干細胞標記物Sox-2、Oct-4和Nanog的表達及定位,結(jié)果如圖2所示。細胞核呈藍色,Sox-2、Oct-4和Nanog蛋白經(jīng)抗體標記后呈綠色,各種蛋白質(zhì)在NT2細胞上均有表達,其中Sox-2和Oct-4的熒光在NT2細胞中定位于細胞質(zhì)（圖2A,B）,Nanog的熒光在NT2細胞中定位于細胞質(zhì),僅有少部分定位于細胞核（圖2C）。相對于對照組細胞,CDDP處理組中細胞的Sox-2和Oct-4表達均無明顯差別（圖2D,E）,而Nanog的表達熒光強度有明顯增強（圖 2F）。

圖1 倒置顯微鏡觀察CDDP對人惡性睪丸生殖細胞瘤NT2細胞形態(tài)的影響（×4,標尺:20μm）（A）NT2細胞正常培養(yǎng)狀態(tài);（B）CDDP處理12 h;（C）CD-DP處理24 h;（D）CDDP處理48 h。Fig.1 The effect of CDDP on the morphology of human malignant testicular teratoma（NT2）observed by inverted microscope（×4,scale bar:20 μm）（A）Normal condition of NT2 cells;（B）Treatment with CDDP for 12 h;（C）Treatment with CDDP for 24 h;（D）Treatment with CDDP for 48 h.

圖2 免疫熒光觀察CDDP孵育48 h NT2細胞中腫瘤干細胞標志物Sox-2、Oct-4和Nanog的定位表達Fig.2 Confocal microscope observation of location and expression of cancer stem cell markers Sox-2,Oct-4 and Nanog in NT2 cells incubated with CDDP for 48 h

2.3 CDDP對NT2細胞Sox-2、Oct-4和Nanog mRNA表達的影響

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,與Control組相比,CDDP處理組NT2細胞中Sox-2、Oct-4和NanogmRNA的表達量均顯著增加（圖3,P<0.05）。CDDP處理12 h、24 h、48 h的NT2細胞中Sox-2 mRNA 表達量分別為 7.07±1.33（t=0.006）、6.31±0.93（t=0.012 6）和 10.34±1.43（t=0.012 7）,Oct-4 mRNA 表達量分別為 10.81±0.25（t=0.000 8）、12.85±0.70（t=0.002 9）和 13.26±0.18（t=0.012 7）,NanogmRNA 表達量分別為 2.99±1.14（t=0.045 7）、6.25±0.81（t=0.014 3）和 5.56±0.85（t=0.007 9）。

圖3 Real-time PCR檢測CDDP在NT2細胞中對Sox-2、Oct-4和Nanog mRNA表達的影響Fig.3 Effect of CDDP on Sox-2,Oct-4 and Nanog mRNA expression in the NT2 cells detected by real-time PCR*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001,experimental group vs.control group;n=3.

2.4 Real-time PCR檢測CDDP對NT2細胞ABCG2 mRNA表達的影響

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:CDDP處理12 h、24 h和 48 h的 NT2細胞中ABCG2 mRNA表達量分別為 2.67±0.51（t=0.022 01）、6.12±0.73（t=0.004 96）和 46.39±18.95（t=0.038 59）,顯著高于對照組（P<0.05）,且表達量隨CDDP處理時間延長而明顯增加（圖4）。

2.5 CDDP對NT2細胞中Sox-2、Oct-4和Nanog蛋白表達的影響

為進一步確定NT2細胞中干性基因的表達,用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測Sox-2、Oct-4和Nanog的表達量。結(jié)果顯示:Control組中Sox-2、Oct-4和 Nanog的表達量分別為 0.078±0.010、0.127±0.017和 0.047±0.005,而在 CDDP 處理 12 h、24 h和48 h的NT2細胞中,Sox-2表達量分別為0.134±0.013、0.133±0.016 和 0.090±0.011;Oct-4表達量分別為 0.165±0.017、0.289±0.020 和0.167±0.013;Nanog 表達量分別為 0.084±0.002、0.131±0.006和0.063±0.005。與 Control組相比,Sox-2在CDDP處理12 h、24 h時有極顯著差異（P<0.001）;Oct-4和Nanog在CDDP處理各時間點均有顯著性差異（P<0.05）。由此得出NT2細胞在CDDP處理后Sox-2、Oct-4和Nanog蛋白的表達水平顯著增加。

3 討論

目前,臨床上治療腫瘤以化療為主,而化療耐藥是腫瘤干細胞的重要特性,也是導致化療失敗和患者術后腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因。現(xiàn)已研究表明,腫瘤干細胞中高表達ABCG2與腫瘤細胞的耐藥性密切相關[9]。Sox-2、Oct-4和Nanog能使體細胞向類ESC（embryonic stem cell）方向轉(zhuǎn)化,在CSCs的各個分化階段這些干細胞因子均呈現(xiàn)高水平表達,在維持腫瘤干細胞的自我更新以及干細胞特性等方面發(fā)揮著重要作用,其表達水平被認為是干細胞多功能性的重要標志[17,18]。

Sox-2是SOX基因家族的重要組成成員之一。研究表明Sox-2作為一個關鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,與人體正常干細胞、腫瘤干細胞的自我更新及多潛能的維持密切相關[19～21]。近年來研究表明Sox-2的異常表達與人體內(nèi)多種腫瘤如卵巢癌、膀胱癌和胰腺癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關,并且Sox-2被認為是腫瘤干細胞的重要標志之一[22～24]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)與鉑類敏感的卵巢癌細胞株相比,Sox-2的表達在鉑類耐藥的細胞株中顯著增加,而且免疫組織化學實驗也驗證了Sox-2蛋白在耐藥細胞中的過表達,推測可能是存活下來的腫瘤干細胞高表達了Sox-2[22]。在胰腺癌的研究中人們同樣發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞往往伴有Sox-2的高表達[23]。大量研究結(jié)果顯示,多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展均與Sox-2的異常表達有關。本研究從形態(tài)學、mRNA水平及蛋白質(zhì)水平對其進行鑒定,結(jié)果表明:與Control組相比,在CDDP處理后的NT2細胞中Sox-2的表達隨處理時間的延長而顯著增加,由此說明NT2細胞對CDDP的耐藥性與Sox-2的干細胞特性密切相關。

Oct-4屬于POU轉(zhuǎn)錄因子成員,是一種多能干細胞標記物,有研究認為Oct-4也與CSCs關系密切[25]。Oct-4基因的高表達在口腔鱗狀細胞癌和胃癌順鉑的耐藥中起著重要的作用[26,27]。本實驗結(jié)果顯示,經(jīng)CDDP作用后的NT2細胞中Oct-4表達明顯高于Control組,表明NT2細胞對CDDP的耐藥性與Oct-4的干細胞特性密切相關。

Nanog是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要的多能干細胞轉(zhuǎn)錄因子,其不僅在維持胚胎干細胞、腫瘤干細胞的干性和自我更新中起重要作用[28～30],而且在卵巢癌[31]、乳腺癌[32]、結(jié)腸癌[33]等多種腫瘤干細中高水平表達。相關研究表明Nanog的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥、轉(zhuǎn)移和復發(fā)等密切相關。Zhang等[31]從卵巢癌組織中成功分離得到CSCs,這群細胞不僅高水平表達Nanog,并且對于化療藥物顯示出較強耐藥性。Huang等[32]從人乳腺癌細胞系中分離得到CSCs,結(jié)果顯示Nanog基因在CSCs中高表達,對化療藥物的敏感性降低。本研究采用實時熒光定量PCR和Western-blot技術對Nanog的表達進行了檢測。結(jié)果顯示,在CDDP處理后的NT2細胞中Nanog的表達明顯高于Control組（P<0.05）,提示Nanog可能通過維持腫瘤干細胞的干性促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

圖5 Western-blot檢測CDDP在NT2細胞中對Sox-2、Oct-4和Nanog蛋白表達的影響Fig.5 Effect of CDDP on Sox-2,Oct-4 and Nanog protein expressions in the NT2 cells detected by Western-blot*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001,experimental group vs.control group;n=3.

腫瘤干細胞是否存在耐藥性已成為目前鑒定腫瘤干細胞的重要環(huán)節(jié),這為耐藥細胞可能更易富集干細胞這一觀點提供了有力的證據(jù)。ABCG2是一種ABC轉(zhuǎn)運蛋白,可外排多種化療藥物,在腫瘤組織和腫瘤干細胞中高表達,從而導致腫瘤對多種化療藥物不敏感,并可作為富集干細胞的一個標志,是目前研究常用的腫瘤干細胞耐藥靶標[34]。本研究采用實時熒光定量PCR技術對ABCG2 mRNA的表達進行了檢測,結(jié)果顯示,與Control組比較,CDDP處理組NT2細胞中ABCG2 mRNA的表達顯著增加,表明ABCG2高表達是人惡性睪丸生殖細胞瘤NT2細胞對CDDP產(chǎn)生耐藥的機制之一。

在本研究中,經(jīng)CDDP處理后的NT2存活細胞中Sox-2、Oct-4、Nanog腫瘤干細胞標記物的mRNA和蛋白質(zhì)水平以及ABCG2 mRNA水平與人惡性睪丸生殖細胞瘤的化療效果有關,其高水平表達或許是化療效果差和耐藥的主要原因之一,提示順鉑導致人惡性睪丸生殖細胞瘤的細胞耐藥可能與腫瘤細胞的干細胞特性增強有關。

近年,隨著對腫瘤干細胞標志物Sox-2、Oct-4、Nanog在多種惡性腫瘤組織和細胞中的功能研究逐漸深入,了解化療藥物處理后腫瘤干細胞相關表型和耐藥相關機制,利用腫瘤干細胞的生物學特性進行靶向治療已成為今后腫瘤研究中的重要方向。因此,探討人惡性睪丸生殖細胞瘤的耐藥機制,對臨床生殖細胞瘤治療過程中尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞耐藥的有效治療策略具有重要意義。