豆瓣發(fā)酵瓣子中淀粉酶高產(chǎn)菌株的篩選及其酶活力的測定

董 丹，陳 燕，關(guān)統(tǒng)偉，車振明

（西華大學(xué) 微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039）

豆瓣發(fā)酵瓣子中淀粉酶高產(chǎn)菌株的篩選及其酶活力的測定

董 丹，陳 燕，關(guān)統(tǒng)偉，車振明*

（西華大學(xué) 微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039）

以郫縣豆瓣不同時(shí)期發(fā)酵瓣子為原料篩選淀粉酶高產(chǎn)菌株，利用淀粉酶水解圈作為篩選模型，通過篩選培養(yǎng)及酶活力的測定，得到產(chǎn)淀粉酶活力相對較高的菌株DD23，為80.24 IU/mL。通過菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，確定DD23為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。

淀粉酶；序列分析；蠟樣芽胞桿菌；酶活力

淀粉酶是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)并且迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑[1]，淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖元等水解α-1,4-糖苷鍵的酶。根據(jù)酶水解產(chǎn)物異構(gòu)類型的不同可分為α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）與β-淀粉酶（EC3.2.1.2）。α-淀粉酶能水解淀粉分子內(nèi)部α-1,4-葡萄糖苷鍵，水解產(chǎn)物為糊精、麥芽寡糖、麥芽糖和葡萄糖[2]。在食品、紡織、醫(yī)藥和飼料工業(yè)領(lǐng)域都有廣泛運(yùn)用[3-6]。β-淀粉酶是一種外切糖苷酶，從淀粉的非還原端開始裂解α-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)物為麥芽糖和β-極限糊精，可應(yīng)用于食品、釀酒等工業(yè)領(lǐng)域[7]。根據(jù)pH穩(wěn)定性不同，淀粉酶又可以分為耐酸型、普通型和耐堿型3類。酸性淀粉酶一般具有較好的耐酸性，通常其最適pH值為4.0～5.0，且在較大的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定；中性淀粉酶的最適pH值為6.0～7.0，其耐酸性明顯低于酸性淀粉酶；而堿性淀粉酶在pH 9.0～11.0的堿性環(huán)境下具有高效催化活性和穩(wěn)定性[8-9]。

郫縣豆瓣是最為出名的四川調(diào)味品之一，被譽(yù)為川菜之魂[10-11]，以色澤油潤紅亮、醬香濃郁、味鮮辣醇和、外觀黏稠絨實(shí)等特點(diǎn)著稱[12-13]。傳統(tǒng)郫縣豆瓣以豆瓣、辣椒為原料，霉菌為主要微生物菌種，經(jīng)自然制曲、天然發(fā)酵而成[14]。制曲的目的是通過米曲霉等菌種在原料上生長繁殖，以便于在發(fā)酵時(shí)利用它們所分泌的多種酶類對原料進(jìn)行酶解，產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮、糖類物質(zhì)及有機(jī)酸，而這些物質(zhì)對于豆瓣發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)的影響有著直接的關(guān)系。目前市售米曲霉是以產(chǎn)中性蛋白酶為主，酸性蛋白酶和淀粉酶活力低，因此本實(shí)驗(yàn)通過對制曲瓣子中高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選，以及將此用于高酶活復(fù)合菌劑的研制，提高豆瓣曲總酶活，改善豆瓣曲的酶系組成，有效提高豆瓣產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮和還原糖含量，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高產(chǎn)品品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

郫縣豆瓣：四川郫縣恒豐和食品有限公司，發(fā)酵時(shí)間為2、5、8個(gè)月樣品共3份，置于4℃冰箱保存，備用。

1.1.2 試劑

核酸染料（Goldview）、三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：上海生工生物工程有限公司；甘油、無水乙醇、異戊醇：成都市科龍劑化工廠；Ex Taq DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：大連Takara公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

淀粉酶篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨2 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀3 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，調(diào)pH值為7。

液體培養(yǎng)基：淀粉10 g，硫酸銨2 g、氯化鈉5 g、硫酸亞鐵0.5 g、磷酸氫二鉀1 g、水1 000 mL，調(diào)pH值為7。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉0.5 g，淀粉0.3 g，硝酸鈉0.3 g，磷酸氫二鉀0.2 g，磷酸二氫鉀1 g，牛肉膏1 g，水1 000 mL，調(diào)pH值為7。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9052型恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LIOOJS-500顯微鏡：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司：1221655搖床：北京科思佳科技有限責(zé)任公司；UV757CRT紫外-可見光分光光度計(jì)：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；Ty10TP100PCR儀：上海普迪生物技術(shù)有限公司；ChemiDoc-It凝膠成像系統(tǒng)：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；LDZX-75KB型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株初篩

取采集到的3份瓣子樣品，用生理鹽水稀釋至10-1、10-2、10-3分別涂布于初篩平板，置于37℃和28℃下培養(yǎng)48 h，形成單菌落，挑選出透明圈明顯的菌落，斜面編號保存，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液淀粉酶活力。

1.3.2 菌株復(fù)篩

取產(chǎn)酶活力大的菌株1環(huán)與100 mL無菌水中，60℃水浴稀釋30 min。在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落長成后選擇水解圈大，菌落小的菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并測定淀粉酶活力。復(fù)篩4輪，選出產(chǎn)酶活力最高的菌株。

1.3.3 酶活測定-碘量法[15]

取5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%可溶性淀粉溶液，在37℃水浴中預(yù)熱10 min，加入適度稀釋的粗酶液0.5 mL，37℃水浴振蕩，準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，用5 mL 0.1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。取0.5 mL反應(yīng)液與5 mL稀碘液顯色，在620 nm波長處測光密度值。以0.5 mL水代替0.5 mL反應(yīng)液為空白，以不加酶液（加同體積的緩沖液）的管為對照。淀粉酶活力根據(jù)以下公式計(jì)算：

式中：R0、R分別表示對照和反應(yīng)液的光密度值；D為酶的稀釋倍數(shù)。

淀粉酶的酶活單位定義：在37℃，pH 6.0條件下5 min內(nèi)水解1 mg淀粉的酶量為1個(gè)活力單位（IU）。

1.3.4 16S rDNA鑒定

菌株液體培養(yǎng)12 h，脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取采用改良十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）[16-17]法。得到的樣品總DNA于-20℃保存。以提取得到的DNA為模板，細(xì)菌選擇通用引物Eμ27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；1490R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應(yīng)條件：95℃、4 min；95℃、60 s；56℃、60 s；72℃、120 s，35個(gè)循環(huán)；72℃、10 min。真菌選擇引物ITS4（5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；ITS5（5'-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。反應(yīng)條件：95℃、4 min；94℃、30 s、53℃、30 s、72℃、40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃、7 min。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系為50μL：10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、Taq酶0.5μL、上下游引物各1μL、ddH2O 37.5μL、DNA模板1μL。PCR產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳時(shí)間40 min。純化過程按照DNA膠回收試劑盒中的步驟進(jìn)行，具體步驟參照OMEGA公司E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit試劑盒說明。PCR產(chǎn)物純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果提交美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩

從各樣品中分離得到28株菌周圍有明顯水解透明圈，樣品稀釋涂布后大約在24 h后陸續(xù)長出單菌落。測量其透明圈半徑，結(jié)果見表1。

由表1可知，篩選出的28株產(chǎn)酶菌株中，BZ16這株菌的水解圈半徑最大，為3.25 cm，其次BZ23、BZ26、BZ27三株菌的水解圈大小僅次于BZ16，分別為3.24 cm、3.20 cm、3.15 cm，由此可以推斷，BZ16產(chǎn)淀粉酶活力可能最高。

將28株產(chǎn)酶菌株進(jìn)一步檢測其產(chǎn)淀粉酶活力，結(jié)果見表2。

由表2可知，產(chǎn)淀粉酶活力最大的是菌株BZ16，為49.79 IU/mL，但菌株整體酶活力較低，還不能滿足實(shí)際生產(chǎn)需要。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

從初篩結(jié)果中挑選產(chǎn)酶活力最高的BZ16菌株進(jìn)行分離純化，在分離培養(yǎng)平板上進(jìn)行培養(yǎng)，待菌落長成后選擇透明圈較大、菌落小的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并測定淀粉酶活力。4輪復(fù)篩之后，選擇產(chǎn)酶活力較大的菌株作為本實(shí)驗(yàn)的目的菌株，復(fù)篩結(jié)果如表3所示。

經(jīng)4輪復(fù)篩過后，得到28株單菌落，由表3可知，復(fù)篩得到的28株菌中產(chǎn)淀粉酶活力最大的菌株為DD23，淀粉酶活力為80.24 IU/mL，因此用菌株DD23作為試驗(yàn)菌株。

2.3 菌落的形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果

菌株DD23菌落在以淀粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)24 h形成乳白色菌落，菌落邊緣不光滑，菌落黏稠，質(zhì)地較密，有透明圈。菌株DD23進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，菌株DD23為革蘭氏陽性菌，最適生長溫度為37℃，最適生長pH值為7.2，糖類發(fā)酵反應(yīng)均為陽性，其中山梨醇反應(yīng)、硝酸鹽反應(yīng)和吲哚反應(yīng)均為陰性。

2.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將DD23測序結(jié)果進(jìn)行拼接過后，在Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對，序列號為JX506729，經(jīng)同源性對比與蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）相似度為100%，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》以及生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，最終確定DD23為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。

3 結(jié)論

淀粉酶作為一種重要的工業(yè)用酶，現(xiàn)已逐步應(yīng)用于洗滌劑添加和紡織退漿等領(lǐng)域，取得了一定使用效果。在提高效率、提高產(chǎn)品質(zhì)量、節(jié)約資源和環(huán)境保護(hù)等方面有著十分重要的作用。但現(xiàn)在對淀粉酶的研究主要集中在淀粉酶生產(chǎn)菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)的研究，而忽略了其產(chǎn)量不能滿足實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的問題，這也阻礙了淀粉酶在實(shí)際生產(chǎn)中的運(yùn)用前景。目前，郫縣豆瓣的生產(chǎn)周期長，產(chǎn)品風(fēng)味不穩(wěn)定，這與發(fā)酵過程豆瓣中酶系的組成有著十分密切的關(guān)系，因此篩選出高產(chǎn)、穩(wěn)定遺傳的菌株對于縮短豆瓣發(fā)酵周期，改善豆瓣風(fēng)味，節(jié)約生產(chǎn)成本非常重要，這也是目前必須解決的問題。本實(shí)驗(yàn)從郫縣豆瓣發(fā)酵2、5、8個(gè)月的瓣子中篩選出的菌株DD23產(chǎn)淀粉酶活力最高，為80.24 IU/mL，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定該菌為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。此發(fā)現(xiàn)對于后續(xù)如何利用高產(chǎn)酶菌株實(shí)現(xiàn)縮短發(fā)酵周期，提高產(chǎn)品風(fēng)味，研究產(chǎn)酶菌株代謝機(jī)理有著極其重要的作用。

[1]張樹政.酶制劑工業(yè)[M].北京：科學(xué)出版社，1984.

[2]楊海泉，劉 龍，李江華，等.堿性淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（4）：432-439.

[3]MALHOTRA R,NOORWEZ S M,SATYANARAYANA T.Production and partial characterization of thermostable and calcium-independent α-amylase of an extreme thermophile Bacillus thermooleovorans NP54 [J].Lett Appl Microbiol,2000,31(5):378-384.

[4]MURAKAMI S,NISHIMOTO H,TOYAMA Y,et al.Purification and characterization of two alkaline,thermotolerantα-amylases from Bacillus halodurans 38C-2-1 and expression of the cloned gene in Escherichia coli[J].Biosci Biotechnol Biochem,2007,71(10):2393-2401.

[5]HASHIMS O,DELGADOO,HATTI-KAUL R,etal.Starch hydrolysing Bacillus halodurans isolatesfrom a Kenyan soda lake[J].Biotechnol Lett, 2004,26(10):823-828.

[6]MURAKAMIS,NAGASAKIK,NISHIMOTO H,et al.Purification and characterization of five alkaline,thermotolerant,and maltotetraose-producingα-amylases from Bacillus halodurans MS-2-5,and production of recombinant enzymes in Escherichia coli[J].Enzyme Microb Technol, 2008,43(4/5):321-328.

[7]LI X,YU H Y.Extracellular production of beta-amylase by a halophilic isolate,Halobacillus sp.LY9[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2011,38 (11):1837-1843.

[8]BURHAN A,NISA U,G?KHAN C,etal.Enzymatic properties of a novelthermostable,thermophilic,alkaline and chelator resistant amylase from an alkaliphilic Bacillus sp.isolate ANT-6[J].Process Biochem, 2003,38(10):1397-1403.

[9]HAGIHARA H,IGARASHI K,HAYASHI Y,et al.Novelα-amylase thatis highly resistant to chelating reagents and chemical oxidants from the alkaliphilic Bacillus isolate KSM-K38[J].Appl Environ Microbiol, 2001,67(4):1744-1750.

[10]劉超蘭，黃 著，彭熙敏，等.乳酸菌和酵母共培養(yǎng)技術(shù)縮短郫縣豆瓣醬陳釀期的應(yīng)用研究[J].中國釀造，2009，28（3）：109-113.

[11]邵 偉，唐 明，藏占鋒，等.傳統(tǒng)豆瓣醬釀造工藝改進(jìn)與優(yōu)化研究[J].中國釀造，2010，29（3）：130-132.

[12]李 峰，趙 萍，周昌豹，等.郫縣豆瓣高酶活米曲霉選育鑒定及復(fù)合菌制曲改善酶系組成研究——郫縣豆瓣高酶活米曲霉的選育鑒定[J].中國釀造，2012，31（12）：32-34.

[13]李幼筠.“郫縣豆瓣”剖析[J].中國釀造，2008，27（11）：83-86.

[14]李從虎，鄭 佳，謝 菲，等.郫縣豆瓣曲曲霉的篩選、分子鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].中國釀造，2010，29（5）：30-34.

[15]白 燕，王維新.刺參腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶與纖維素酶活性的測定方法[J].飼料工業(yè)，2012，33（20）：28-32.

[16]CHEN Q,WEIS,DENG Z,etal.Optimization of DNA extraction from seeds of Sorghum sudanense(Piper)Stapf[J].Not Bot Hort Agrobot Cluj,2009,37(1):256-260.

[17]MISHRA M K,RAN N S,RAM A S,et al.A simple method of DNA extraction from coffee seedssuitable forPCRanalysis[J].Afr J Biotechnol,2008,7(4):409-413.

Screening of high yield amylase-producing strains from fermented soybean paste and the enzyme activity determination

DONGDan,CHEN Yan,GUAN Tongwei,CHE Zhenming*

(Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province,Institute of Microbiology, Xihuan University,Chengdu 610039,China)

Differentperiods of Pixian soybean paste was selected as raw materialto screen high yield amylase-producing strains,and amylase hydrolysis circle was used as a screening model.Through the screening culture and enzyme activity determination,the results showed thatstrain DD23 had the highest enzyme activity which achieved 80.24 IU/ml.Through colonial morphology observation and 16S rDNA sequence analysis,the strain DD23 was identified as Bacillus cereus.

amylase;sequence analysis;Bacillus cereus;enzyme activity

TQ925

A

0254-5071（2015）02-0068-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.016

2014-12-19

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目（13205639）；食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（Szjj2013-045）；四川省教育廳基金項(xiàng)目（13205688）

董 丹（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ?/p>

*通訊作者：車振明（1960-），男，教授，本科，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵技術(shù)。