褐飛虱ABCG基因的克隆與表達分析

閘雯俊，王芳芳，李三和，胡剛，陳志軍，劉凱，周雷，楊國才，游艾青

摘要：三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette， ABC）廣泛分布于各種生物體中，是最大的膜蛋白家族之一。在昆蟲中，ABC轉運子不僅在分子轉運過程中有重要的功能，同時在殺蟲劑抗性、代謝和發(fā)育中都起到重要的作用?？寺『丸b定了褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l， BPH）ABCG基因 （NlABCG），結果表明NlABCG基因全長1 222 bp， 含有一個長度為789 bp的開放閱讀框，編碼263個氨基酸。NlABCG蛋白與內(nèi)華達古白蟻（Zootermopsis nevadensis） ABCG的同源性最高，達到69%。利用qRT-PCR 檢測NlABCG基因在褐飛虱不同發(fā)育階段和不同組織中的表達，發(fā)現(xiàn)NlABCG 轉錄本在褐飛虱的所有發(fā)育階段都有表達，在1齡若蟲中表達量最低，隨著生長發(fā)育表達量逐漸升高。NlABCG在褐飛虱5齡若蟲的中腸中表達量最高。NlABCG基因的序列特征和表達譜非常保守，為其功能的分析提供了信息。

關鍵詞：褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l， BPH）;NlABCG;克隆

中圖分類號：S435 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5871-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn 0439-8114.2014.23.064

ABC 轉運蛋白最早發(fā)現(xiàn)于細菌，是細菌質膜上的一種具有運輸功能的 ATP 酶（Transport ATPase），是一個龐大而多樣化的蛋白家族。ABC轉運蛋白是膜整合蛋白，它通過利用 ATP 水解過程釋放的能量對溶質中各種生物分子進行跨膜轉運，其轉運的底物包括糖、氨基酸、金屬離子、多肽、蛋白質、細胞代謝產(chǎn)物和藥物等[1]。ABC 轉運蛋白在生物體內(nèi)以全分子或半分子轉運蛋白的形式存在，全分子轉運蛋白由2個核苷酸結合域（Nucleotide ?bindingdomain，NBD）和2個跨膜結構域（Transmembrane domain，TMD）構成，每個半分子轉運蛋白包括1個NBD和1個TMD，NBD位于細胞質內(nèi)，在 NBD內(nèi)有一個約200個氨基酸構成的保守序列，包含了3個保守區(qū)域，分別為Walker A（P-loop）、Walker B和特征基序 C（也稱 Signature 基序或特征基序S）[2]，其中 Walker A和B是所有的核苷酸結合蛋白所共有的，而Signature基序是ABC轉運蛋白特有的。

ABC轉運蛋白可以分為轉入蛋白、轉出蛋白和非轉運蛋白[3]。研究表明在昆蟲中，ABC轉運蛋白的功能已經(jīng)影響昆蟲代謝和發(fā)育[4]。褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l，BPH）屬同翅目飛虱科昆蟲，又稱褐稻虱。褐飛虱是水稻主要害蟲之一，在我國長江流域和華南及西南廣大稻區(qū)發(fā)生頻繁、危害嚴重[5]。本研究從褐飛虱體內(nèi)分離得到NlABCG基因的全長，同時分析了NlABCG基因結構，并對其在發(fā)育過程中和不同組織中的表達進行分析， 以期為研究其進化提供新的資料， 為研究褐飛虱NlABCG基因的功能和在ABC轉運蛋白中的價值提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料 ?褐飛虱品種（生物型Ⅱ）為武漢大學收藏，飼養(yǎng)在感蟲水稻品種臺中1號（TN1）植株上，環(huán)境條件為（25±2） ℃，80%的相對濕度，光照周期為16 h光，8 h黑暗。

1.1.2 ?試劑 ?試驗所用大腸桿菌E. coli DH5α， ExTaq酶、逆轉錄試劑盒和pMD18-T克隆載體，5′-Full RACE 和3′-Full RACE試劑盒購自Takara 公司。引物合成及序列測定由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總RNA的提取 ?使用總RNA提取試劑盒RNAiso Plus提取褐飛虱發(fā)育時期和成體不同組織的總RNA。將溶于無核酸酶水中的RNA置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 ?cDNA克隆 ?利用Tribolium castaneum的ABC transporter蛋白（GenBank登錄號： XP_97173

5.1）在褐飛虱的ESTs數(shù)據(jù)庫（http：//bphest.dna.affrc.go.jp/）中進行TBLASTN查詢，得到相應的EST片段。以該EST序列為模板設計RACE引物。以提取的總RNA為模板，使用RACE試劑盒分別合成5′和3′RACE cDNA。以合成的cDNA第一鏈為模板，進行Outer PCR反應和Inner PCR反應，反應引物見表1。Outer PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸2 min， 20個循環(huán)后72 ℃再延伸10 min。Inner PCR反應程序與以上程序一樣，只是改為30個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物利用寶生物工程（大連） 有限公司試劑盒回收，與pMD18-T載體連接。陽性克隆由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序。

1.2.3 ?實時熒光定量PCR檢測NlABCG轉錄差異 ?取不同生長發(fā)育時期褐飛虱和褐飛虱不同組織總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄獲得褐飛虱的cDNA。在Roteogene 6000TM型定量PCR儀上進行10 μL體系的PCR反應，反應條件如下：94 ℃預變性2 min，然后以30～40個循環(huán)進行PCR擴增 ?（94 ℃ 20 s， 55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s） 每個樣品3個重復，取平均值。以褐飛虱Actin作為參照基因，采用2-ΔΔ Ct方法[6]比較不同樣品基因表達水平。endprint

1.2.4 ?生物信息學分析 ?對5′RACE序列和3' RACE 序列測序后拼接獲得cDNA全長。用ExPASy Translate tool軟件（http：//web.expasy.org/translate/）進行翻譯得到相應cDNA編碼框的預測，再利用下列在線工具進行蛋白質序列的功能域及結構域的預測：用Clustalw（http：//www.genome.jp/tools/clustalw/）進行同源序列比對;用MEGA 4.0軟件進行進化樹的繪制;用ExPASy Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）進行分子量和等電點分析;用http：//npsa-pbil.ibcp.fr/進行二級結構的預測。

2 ?結果與分析

2.1 ?褐飛虱NlABCG基因的克隆

以該EST序列為模板設計RACE引物，克隆得到NlABCG基因（GenBank登錄號： KM115648）的5′ cDNA 片段和3′ cDNA片段（圖1）。5′cDNA 序列長度約為0.8 kb，3′ cDNA序列長度約為0.4 kb。全長序列經(jīng)過測序拼接后，全長為1 222 bp，含有一個編碼263個氨基酸的開放閱讀框（ORF）。

2.2 ?NlABCG蛋白質分析鑒定

NlABCG基因編碼263個氨基酸，結果見圖2。應用Computer pI/Mw Tool軟件分析預測NlABCG的分子量為28.7 kDa，等電點為6.44。二級結構預測分析發(fā)現(xiàn)，NlABCG蛋白質α螺旋占35.74%，延伸鏈占15.59%，隨機卷曲占46.01%（圖3）。

通過 NCBI的 Blastp （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）程序進行在線蛋白質序列比對，結果表明該基因與其他昆蟲的ABCG蛋白序列相似性大于63%（表2）。如，與內(nèi)華達古白蟻（Zootermopsis nevadensis）ABCG1的同源性為69%，與豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）ABCG4和佛羅里達弓背蟻（ Camponotus floridanus）ABCG4的同源性為67%，與切葉蟻（Acromyrmex echinatior）ABCG4﹑畢氏粗角猛蟻（Cerapachys biroi）ABCG和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）ABCG1的同源性為66%，與金小蜂（Nasonia vitripennis）ABCG4的同源性為63%。由此可以看出，褐飛虱NlABCG與其他昆蟲的 ABC 轉運蛋白序列相似性較高，其序列相當保守。

2.3 ?NlABCG分子進化分析

用 NlABCG編碼的氨基酸序列與蜜蜂、家蠶、人體虱、佛羅里達弓背蟻、豌豆蚜、切葉蟻、內(nèi)華達古白蟻、赤擬谷盜、畢氏粗角猛蟻、金小蜂中可能的ABCG亞族成員進行聚類分析，結果發(fā)現(xiàn)NlABCG與內(nèi)華達古白蟻、赤擬谷盜和豌豆蚜中可能的 ABCG亞族成員聚類在一起，親緣關系較近，而與其他昆蟲的ABCG亞族成員親緣關系相對較遠（圖4）。

2.4 ?褐飛虱NlABCG基因不同生長發(fā)育時期和組織的分析

為了解NlABCG基因在褐飛虱不同生長發(fā)育階段蟲體中和在蟲體不同組織中的轉錄情況，分別提取1齡至5齡若蟲和雌雄成蟲蟲體的總RNA以及5齡若蟲的中腸、唾液腺、脂肪體、表皮、腿和頭部組織的總RNA，利用實時熒光定量PCR法檢測該基因在褐飛虱不同發(fā)育階段蟲體中和不同組織中的表達情況。試驗結果表明，該基因在雌成蟲的表達量較高（圖5）。不同組織中，在中腸的表達量最高（圖6）。

3 ?小結與討論

本研究克隆得到NlABCG基因的全長，并且將氨基酸序列與其他昆蟲的ABCG進行序列比對，發(fā)現(xiàn)其與內(nèi)華達古白蟻、赤擬谷盜、豌豆蚜的ABCG蛋白在進化上親緣關系較近。對褐飛虱ABCG蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質α螺旋占35.74%，延伸鏈占15.59%，隨機卷曲占46.01%。同時鑒定了NlABCG基因在褐飛虱不同生長發(fā)育階段蟲體和在蟲體不同組織中的轉錄情況，該基因在雌性成蟲中的表達量較高。在不同組織中，在中腸的表達量最高。中腸組織是昆蟲腸道組織中惟一與細胞表面直接接觸的。研究表明，家蠶中的ABCG基因是特異表達的，在蛻皮和化蛹期間受20E正調節(jié)[7]。

因此，褐飛虱NlABCG基因的表達特征表明，利用農(nóng)藥防治褐飛虱的最佳時期是在早期。這些結果有利于開發(fā)一些以NlABCG基因為靶標的安全有效的殺蟲劑，同時可以利用RNA干擾的方法來抑制ABC轉運蛋白的表達，以達到控制害蟲的目的。

參考文獻：

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