食物源降血壓肽的制備與功能評價

李 慧，呂 瑩，丁 軻，韓 濤

(農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室/北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

目前，高血壓是一個全球性健康問題，據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)有高血壓患者近2.5 億。通過使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑 (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor，ACEI)可抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性，使血管緊張素Ⅱ的生成和激肽的破壞均減少，可使血壓下降，達(dá)到一定治療高血壓的效果［1］。ACEI 類藥物是降血壓藥物中發(fā)展最快的一類，合成的降血壓藥物約有200多種，均需終身服用，且副作用大［2］。越來越多的專家和患者把目光投向食物中的營養(yǎng)物質(zhì)，希望通過天然物質(zhì)的攝入來輔助調(diào)節(jié)人體血壓。源于食品的降血壓肽具有降血壓效果且不會對人體產(chǎn)生副作用，僅對高血壓患者起降壓作用，對正常人無降壓作用。許多研究者從不同的動植物蛋白中分離提取出多種天然的ACE 抑制肽(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides，ACEIP)，開發(fā)天然降血壓肽產(chǎn)品成為降血壓藥物的一個研究方向。

1 降血壓肽研究進(jìn)展概述

自1965年從蛇毒中發(fā)現(xiàn)ACEIP 以來，降血壓肽的研究引起了廣泛關(guān)注。日本最早從價廉的水產(chǎn)魚蛋白質(zhì)中開發(fā)出有效的ACEIP，如酶解鰹魚蛋白制備降血壓肽，并進(jìn)行動物實驗及臨床實驗，證明是有效的降壓食品［1］。據(jù)日本1992年專利記載，降血壓肽已從胰凝乳蛋白酶處理的小麥谷蛋白中分出，該肽(2g/kg)通過腹腔給予具有高血壓的小鼠，3h 后，小鼠血壓自200 mm-Hg 降至184mmHg。1995年Fujita［3］等通過酶解法從雞蛋中發(fā)現(xiàn)第一個降血壓肽Ovokinin，氨基酸序列為Phe-Arg-Ala-Asp-His-Pro-Phe-Leu。吳建平和丁霄霖［4］以大豆為原料，對降壓肽制備、高活性ACEIP 的酶系篩選、及酶解條件的優(yōu)化進(jìn)行了研究。近年來，已對多種食物蛋白中降血壓肽進(jìn)行了研究，原料包括谷類、豆類、肉類、乳類及一些副產(chǎn)物中的廢棄蛋白等。

降血壓肽作為ACEI 在所有生物活性肽中研究得最為成熟，潛在應(yīng)用價值最高。研究認(rèn)為，ACEIP 的C 端是Pro 或芳香族氨基酸或N 端含有疏水氨基酸是維持高活性的共同特征［5］?，F(xiàn)已從多種蛋白原料的酶解產(chǎn)物中分離鑒定了多種結(jié)構(gòu)、序列及長度不一的ACE 抑制肽［6］。目前，降血壓肽的研究熱點為酶的篩選、肽的分離純化等環(huán)節(jié)，人們對降血壓肽的效與量較為重視，但只有能抵抗胃腸消化酶消化，或被胃腸消化酶、ACE 降解成更小片段的具有體內(nèi)降壓效果的ACEIP，是研究的重點［7］。本文就不同食物來源降血壓肽的制備、分離純化及功能評價等環(huán)節(jié)進(jìn)行綜述。

2 降血壓肽的制備

目前，降血壓肽制備方法主要有化學(xué)合成法、自溶法、DNA 重組技術(shù)、酶解法(直接酶解、微生物發(fā)酵)等。其中，化學(xué)合成法可制取任意需要的活性肽，但成本高、副反應(yīng)物及殘留物較多;自溶法由于原料范圍較窄，使用受限;DNA 重組技術(shù)多用來合成長肽和蛋白質(zhì)，ACE 抑制肽大部分為短肽，可通過基因重組、工程菌的發(fā)酵和高效表達(dá)加以實現(xiàn)［8］;酶解法具有高效性和專一性，可根據(jù)不同的原料選擇合適的酶及酶解條件，對蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值破壞小、最為常用，前人對該方法的工藝做了很多研究，研究目的是要找到水解特定原料蛋白的最適酶及酶解過程的條件，如底物濃度、酶底比、最適溫度和最適pH 等。

2.1 單酶水解法

用脫脂米糠提取類阿片拮抗肽后的殘留蛋白作為試驗原料，采用胰蛋白酶、胰酶、堿性蛋白酶、Flavourzyme、Protamex 和中性蛋白酶酶解米糠蛋白，底物濃度為1mg/mL，水解250 min，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解物具明顯ACE 抑制活性;不同水解度(DH)的酶解產(chǎn)物對ACE 抑制活性存在較大差異，DH 增加，酶解物的ACE 抑制活性增加;當(dāng)DH 為15.4%時，ACE 抑制活性最高，繼續(xù)增加DH，酶解物ACE 抑制活性反而下降［9］。

用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶分別酶解麥胚蛋白生產(chǎn)降血壓肽，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶在pH 9、50—55℃、加酶量24AU/kg 條件下，水解產(chǎn)物活性最高，ACE 抑制率88.46%［10］。用以上蛋白酶水解大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶制備的大豆肽ACE 抑制率最高，最優(yōu)條件:55℃，pH 9.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，酶添加量8 000U/g，5h［11］。利用堿性蛋白酶Alcalase、木瓜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶分別水解螺旋藻(Spirulina platensin)蛋白，發(fā)現(xiàn)Alcalase 水解產(chǎn)物具有較高ACE抑制率;調(diào)節(jié)pH 8.5，50℃，以底物濃度2% (w/w)，E/S 0.04% (v/v)加入Alcalase 酶解10h，經(jīng)超濾膜過濾后得到具ACE 抑制活性的肽，IC50為0.23mg/mL (水解產(chǎn)物IC500.47mg/mL)［12］。

2.2 復(fù)合酶水解法

將胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶兩兩復(fù)合酶解麥胚蛋白生產(chǎn)降血壓肽，活性最高組合為堿性蛋白酶加胃蛋白酶，ACE 抑制率88.32%［10］。

堿性蛋白酶和中性蛋白酶分步水解玉米蛋白分離液，調(diào)節(jié)pH 8.5，55℃，以E/S 1∶100 加堿性蛋白酶酶解3h，再以相同E/S 加中性蛋白酶，pH7.0，45℃酶解2h，經(jīng)離心、膜過濾后得到玉米低聚肽，ACE 抑制IC50為1.020mg/mL［13］。利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解紅小豆蛋白，酶解產(chǎn)物又在體外模擬胃腸體系中進(jìn)行酶解，最終水解物的ACE 抑制IC5067.2μg/mL［14］。由堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解大西洋鮭魚皮，調(diào)節(jié)pH 8.5，50℃，以E/S 1∶100 加堿性蛋白酶酶解3h，再以E/S 1∶50 加木瓜蛋白酶，pH7.0，60℃酶解2h，經(jīng)離心、膜過濾得到鮭魚皮膠原肽(SSCP)，ACE 抑制IC50為1.165mg/mL［15］。

2.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)多肽不需要蛋白酶的提取過程，微生物在生長過程中可產(chǎn)生各種酶類，是由多種蛋白酶組成的復(fù)合酶系，包括細(xì)胞壁結(jié)合的蛋白酶，還有一系列細(xì)胞內(nèi)肽酶，如肽鏈內(nèi)切酶、氨基肽酶、二肽酶、三肽酶［8］。因而，菌種的選擇對發(fā)酵法制備降血壓肽有重要意義。

Nejati［16］等篩選出乳酸菌Lactococcus lactis DIBCA2發(fā)酵牛乳，用RP-HPLC 分離發(fā)酵乳中的肽，得到最高的ACE 抑制率IC505mg/mL。徐麗丹［17］從36 株耐酸耐膽鹽的供試菌株中篩選出5 株活性菌株的發(fā)酵乳，具有較強(qiáng)ACE 抑制活性，其中DM9028 菌株發(fā)酵乳的ACE抑制率為80.69%，菌株DM9057 發(fā)酵乳對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)有明顯的降壓效果，對正常SD 大鼠未觀察到明顯的降壓作用［17］。

傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品中含豐富的降血壓肽，Nakahara等通過提高醬油釀造原料中蛋白含量，縮短發(fā)酵時間，選用富含分生孢子的發(fā)酵劑Tane koji 進(jìn)行釀造，所得釀造醬油(FSS)總肽濃度比常規(guī)醬油提高2.7 倍，經(jīng)SHR 及Dahl salt-sensitive rats 實驗，均顯示FSS 具有降血壓活性，純化后得到活性最高的肽Ala-Trp (IC5010μg/mL)［18］。

2.4 DNA 重組

近年開始將DNA 重組技術(shù)用于降血壓肽的研究中，為降血壓肽制備實現(xiàn)工業(yè)化打下基礎(chǔ)。饒勝其［19］等通過基因工程技術(shù)得到重組降血壓肽多聚體，經(jīng)胃腸酶作用后的水解液具有很強(qiáng)的ACE 抑制活性，IC5035.2μg/mL。孫海燕［20］等對重組降血壓肽的高效表達(dá)進(jìn)行研究，將表達(dá)產(chǎn)物分離純化，得到3 個較高純度的降血壓肽:Val-Leu-Pro-Val-Pro、Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro、Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg，IC50分別為1.8、4.6 和2.9μmol/L。

3 酶解物的分離純化及其活性大小的評價

通過超濾、Sephadex G-15 對鯊魚肉蛋白酶解液(IC500.4 mg/mL)進(jìn)行分離，得到的活性組分用C18-10柱進(jìn)一步分離，最后得到4 個ACE 抑制活性肽，LC/MS-MS 測定其序列分別為Cys-Phe、Glu-Tyr、Phe-Glu 和Met-Phe，其中前3 個肽首次從鯊魚蛋白中提出，IC50分別為1.96、2.68、1.45μM［21］。

Doyen 等［22］在超濾膜的堆疊電滲析池中進(jìn)行β-乳球蛋白的酶解及肽的分離，240min 后分別在陰離子和陽離子肽回收室檢測到15 個陰離子肽和4 個陽離子肽;回收的15 個陰離子肽中有2 個降膽固醇肽，3 個降血壓肽和1 個抗菌肽，其集中遷移率介于5.5%和81.7%;在4個陽離子肽中，序列為Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg 的肽之前被鑒定為lactokinin 并可發(fā)揮降壓活性。該方法是第一次在電場下同時分離陰離子肽和陽離子肽。

經(jīng)C18 柱對玉米低聚肽進(jìn)行分離純化，得到活性最高組分A，IC50為0.082mg/mL，經(jīng)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀電噴霧離子聯(lián)用(Q-TOF2/ESI)分析組分序列結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Ala-Tyr 具有強(qiáng)ACE 抑制作用，IC50為0.037mg/mL［13］。C18 柱對鮭魚皮膠原肽(1.0mg/mL SSCP ACE抑制率為44.12%，IC50為1.165mg/mL)進(jìn)行分離純化，得到11 個活性組分，組分5 和7 有較高ACE 抑制活性，分別為91.10%、80.51%;經(jīng)Q-TOF2/ESI 分析，對其中二肽序列Ala-Pro 和Val-Arg 進(jìn)行合成并測定ACE 抑制活性，IC50分別為0.060 和0.332mg/mL［15］。相同方法對烏骨雞肌肽(IC50為2.86mg/mL)進(jìn)行分離純化，得到5 個活性組分，對活性較高組分3-5 進(jìn)行測序，得29個肽，將其中11 個肽合成并測定ACE 抑制活性，其中Lys-Pro-Gly-Val、Asn-Met、Leu-His 呈現(xiàn)強(qiáng)ACE 抑制活性，Leu-Glu-Arg、Gly-Ala-Gly-Pro 有較強(qiáng)活性，IC50分別為45.62μM、253.07μM［15］。

利用凝膠過濾層析對螺旋藻(S.platensin)酶解產(chǎn)物(MW 0-3000D)進(jìn)行分離，得到5 個吸收峰，其中組分IV 具有較強(qiáng)ACE 抑制率，IC50為0.091mg/mL，該組分經(jīng)C18 進(jìn)一步分離，得到有較強(qiáng)ACE 抑制活性的組分B，IC50為0.0039mg/mL，再經(jīng)C18 分離僅出現(xiàn)單峰，其IC50為0.0021 mg/mL，氨基酸序列為Ile-Gln-Pro［12］。

采用Sephadex G-25 和RP-HPLC 對西班牙干火腿中水溶性肽提取物進(jìn)行分離，通過nLC-MS/MS 得到73 個多肽序列，分子量集中在374-1610D，主要是5-14 氨基酸殘基的肽，其中ACE 抑制活性最高的肽為Ala-Ala-Ala-Thr-Pro，IC50100μM，此肽經(jīng)SHR 口服8h 后，收縮壓下降25.65±4.50 mmHg［24］。

海蜇蛋白經(jīng)胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解，2000D 超濾膜后，濾液IC50為1.28mg/mL，由SP-Sephadex C-25和Sephadex G-25 進(jìn)一步分離，得到活性高的組分再用ODS 柱分離，最終得2 個ACE 抑制肽，其氨基酸序列確定為Gln-Pro-Gly-Pro-Thr 和Gly-Asp-Ile-Gly-Tyr，ACE抑制活性IC50分別80.67 μM 和32.56 μM，SHR 經(jīng)口服后，血壓明顯下降［25］。

Alcalase 酶解輪蟲(Brachionus rotundiformis)蛋白所得酶解液IC50為0.63 mg/mL，經(jīng)Sephadex G-25 分離，再由ODS 得到純化的ACE 抑制肽，IC50為9.64 μM，氨基酸組成Asp-Asp-Thr-Gly-His-Asp-Phe-Glu-Asp-Thr-Gly-Glu-Ala-Met，分子量1538D［26］。

可以看出，具有ACE 抑制活性的肽結(jié)構(gòu)中，N 端疏水氨基酸、C 端Pro 和C 端芳香族氨基酸出現(xiàn)頻率較高，依次為53.3%、26.6%、33.3%。另外，分子量在500D 以下的小肽居多。

4 降血壓肽的功能評價

目前食源性降血壓肽的評價方法主要有體外和體內(nèi)實驗。前者主要是測定多肽對ACE 的抑制能力，檢測方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法、熒光法等。體內(nèi)實驗有動物實驗和人體臨床實驗。

4.1 體外實驗

體外實驗使用較廣泛的是1971年Cushman 和Cheung 建立的紫外分光光度法，根據(jù)ACE 在體內(nèi)特異性切下肽C 末端的2 個氨基酸的作用原理，選擇含有馬尿酸(Hip)的三肽作為底物，通過測定加入抑制劑前后生成馬尿酸的紫外吸收差別可得抑制活性的大小，但該方法對實驗操作要求高，易產(chǎn)生誤差。第2 種是色譜法，通過測定ACE 抑制劑加入前后，馬尿酸出峰面積的變化來計算抑制率，該方法準(zhǔn)確度高，檢測時間較短，適合于降血壓肽的快速篩選［27］。還可采用微膠束毛細(xì)管電泳定量分析馬尿酸，縮短分析時間和提高精確度［28］。第3 種是可見分光光度法，將底物由含有馬尿酸的三肽換為藍(lán)色的Phe-Ala-Pro-Gly-Gly，在ACE 作用后，通過光吸收減弱的程度來評價ACE 抑制肽的活性，此法較前兩種更加方便實用［29］。

此外，用酶偶聯(lián)法測定ACE 抑制肽活性，是以Hip-Gly-Gly 為底物，生成Hip 和雙甘肽，再加入L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN)和γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)，催化生成3-羧基-4-硝基苯胺，于410nm 檢測光吸收，操作簡便，重復(fù)性好［10］。

4.2 動物實驗

許多研究表明，食物源降血壓肽ACE 抑制活性結(jié)果和動物模型降血壓的結(jié)果并不完全吻合［2］，因而這類肽的降血壓功能需要在高血壓動物模型身上進(jìn)行評價與確認(rèn)。每日給40 只SHR (隨機(jī)分成5 組)口服0.45、1.35、4.05g/kg 的玉米低聚肽，連續(xù)8w，以蒸餾水和10mg/kg 卡托普利分別作陰性和陽性對照，測量收縮壓(SBP)，與陰性對照相比，0.45g/kg 劑量組大鼠從第6w，SBP 明顯降低，約40mmHg;1.35g/kg 劑量組在8w后SBP 降低了35mmHg;4.05g/kg 劑量組SBP 略有降低，但變化不明顯，其中陽性對照第4w 顯著降低了45mmHg［13］。

以10 mg/kg 給SHR 喂螺旋藻肽Ile-Gln-Pro，以相同濃度卡托普利作陽性對照，測SBP 和舒張壓(DBP)，4、6、8h SHR 的SBP 和DBP 均有明顯降低，陽性對照在2、4、6、8h 的值均低于實驗組［12］。Lee［30］等以10 mg/kg·bw 給SHR 口服金槍魚組織蛋白水解肽，以卡托普利作陽性對照，9h 內(nèi)SHR 的收縮壓均呈現(xiàn)降低趨勢，6h 時實驗組和對照組收縮壓均下降最大，分別下降21、26mmHg。

4.3 人體臨床實驗

臨床試驗是檢驗ACEIP 效果的最終方法，但降血壓肽或含降血壓肽的食品在人體中的功能研究十分缺少，目前相關(guān)研究結(jié)果還未出現(xiàn)負(fù)面的報道。Sekiya［31］等以酪蛋白的胰蛋白酶水解液進(jìn)行人體試驗，給4 個血壓正常自愿受試者20g 和40g 的單劑量上述水解產(chǎn)物，均未出現(xiàn)血壓和脈搏率的改變;給4 個輕度高血壓受試者10g 和20g 的單劑量上述產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)血壓有降低趨勢，脈搏率未有改變;另外一組18 個輕度高血壓受試者每日攝入20g 上述產(chǎn)物4w 后，血壓降低了4.6mmHg/6.6mmHg，脈搏率未改變［31］。用鰹魚水解物作臨床交叉實驗，61 位自愿臨界高血壓和輕度高血壓受試者中，第1 組30人，按125 mg/kg·bw 服用水解物，第2 組31人，服用安慰劑;5w 后，服用水解物的受試者收縮壓下降了11.7 mmHg，舒張壓下降了6.9 mmHg;隨后兩組交換服用物，交叉后服用水解物的受試者收縮壓下降了9.4 mmHg，舒張壓下降了4.6 mmHg，所有受試者體質(zhì)指數(shù)沒有明顯的變化，表明水解物對人體沒有副作用［32］。

5 結(jié)論

食物源降血壓肽具有良好的降血壓效果和較高的安全性，在功能性食品及藥品的開發(fā)方面有廣泛的應(yīng)用前景。降血壓肽的研究重點主要在以下方面有待攻關(guān):降血壓肽的制備中酶的篩選、復(fù)合及條件優(yōu)化需進(jìn)一步探索;低成本高效的工業(yè)化分離純化方法還有待進(jìn)一步開發(fā);ACEIP 的動物實驗和臨床實驗方面的研究還需加強(qiáng)，以確定其體內(nèi)降血壓效果;另外，明確較高降血壓活性肽的氨基酸序列，為降血壓肽的結(jié)構(gòu)和功效之間的關(guān)系提供理論參考。

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