同時檢測四種常見真菌毒素HPLC法的初步評價

王萍，王攀，陳建彪，董麗娜，趙明明，嚴(yán)偉，丁華，周有祥

摘要：真菌毒素是絲狀產(chǎn)毒真菌生長過程中分泌的對人畜健康有害的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于多種農(nóng)產(chǎn)品中。對已建立的同時檢測黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素和桔霉素的方法，對其方法檢出限、定量限、精密度和回收率進(jìn)行了評價。該方法對上述4種真菌毒素的檢出限分別為2.12、5.46、2.39和53.10 μg/kg，定量限分別為8.48、21.82、9.57和212.38 μg/kg;加標(biāo)回收試驗中4種毒素的回收率分別為81.43%，75.19%，80.44%和98.54%。該法簡單、快速、高效，適合于批量樣品分析，具有應(yīng)用推廣前景。

關(guān)鍵詞：真菌毒素;同時檢測;檢出限;定量限;回收率

中圖分類號：O657.7 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5839-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.055

真菌毒素（Mycotoxin）是絲狀真菌生長過程中產(chǎn)生對人畜健康有害的次級代謝產(chǎn)物，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為食源性疾病的3大根源之一[1，2]。常見真菌毒素包括：黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）和桔霉素（Citrinin，CIT）等，主要來源于3個屬，曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬[2]。由于產(chǎn)毒真菌多為腐敗菌，極易在農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)、運(yùn)輸、加工、儲藏和銷售等過程中污染農(nóng)產(chǎn)品，但在現(xiàn)有生產(chǎn)力條件下，尚無法完全杜絕真菌毒素進(jìn)入人類食物鏈[3]。農(nóng)產(chǎn)品一旦被產(chǎn)毒真菌侵染，不僅帶來經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重威脅到消費者健康，為了控制真菌毒素對危害，世界各國均制定了嚴(yán)格的真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前，真菌毒素的檢測方法絕大部分為單一毒素或者同類毒素的分析方法，但這類方法成本高，或者重現(xiàn)性差[4]，而且真菌毒素分布廣，對全部毒素進(jìn)行分析，不僅效率低，成本高，環(huán)境污染也大[5，6]。因此建立高通量、準(zhǔn)確、快速和低成本的真菌毒素檢測技術(shù)，對于保障食品安全問題具有較好的現(xiàn)實意義。本試驗依據(jù)本課題組已建立的AFB1、CIT、OTA和ZEN同時提取和檢測的HPLC方法，對該法的檢出限、定量限、精確度以及回收率等4個指標(biāo)進(jìn)行分析，探討本方法的適用性。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與試劑

大米樣品為實驗室收集的無污染稻米樣品。4種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品購于瑞士Alexis公司，純度大于98%。常規(guī)試劑均為分析純試劑，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;試驗用水為去離子水。

1.2 ?儀器與設(shè)備

2695-2475型高效液相色譜儀-多通道熒光檢測器（HPLC-FLD）（Waters，美國）;Laborota-4010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph，德國）;MS1振蕩器（IKA，德國）。

1.3 ?方法

1.3.1 ?真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液 ?分別稱取一定量AFB1、CIT、OTA和ZEN的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋為30 μg/mL的AFB1、CIT、OTA和ZEN的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封后，避光4 ℃冷藏。

1.3.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?取適量的儲備液，以乙腈配制5個不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用HPLC進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，毒素絕對量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 ?樣品分析 ?具體方法參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.4 ?方法檢測限 ?根據(jù)上述分析方法，參照文獻(xiàn)[8]，以產(chǎn)生儀器信噪比2～5倍響應(yīng)值所對應(yīng)濃度（含量）的樣品進(jìn)行7次平行測定，計算測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照公式（1）計算方法檢出限，并以3倍方法檢出限作為方法的測定下限。

方法檢出限=t（n-1，0.99）×S（1）

其中：n為樣品平行測定的次數(shù);t為自由度，為n-1，置信度為99%時的t分布（單側(cè)）;S為n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。當(dāng)自由度為n-1，置信度為99%時的t值為3.14。

1.3.5 ?方法精密度 ?配制含不同濃度毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液做精密度測定，各個樣品平行測定7次。

1.3.6 ?回收率分析 ?分別在大米樣品中添加3個水平的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，按照標(biāo)準(zhǔn)方法的分析步驟進(jìn)行回收試驗，平行測定7次，計算其相對誤差和相對誤差的最終值。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別以4種真菌毒素的峰面積為縱坐標(biāo)，毒素絕對量為橫坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：黃曲霉毒素B1為y=842 680x+112 127，R2=0.991 8;桔霉素為y=2 101 766x-42 328，R2=0.990 0;赭曲霉毒素A為y= 2 948 377x-1 586 502，R2= 0.999 2;玉米赤霉烯酮為y=279 111x-114 263，R2=0.998 4。

2.2 ?真菌毒素的色譜圖

采用上述液相條件，4種真菌毒素的色譜圖見圖2。

2.3 ?方法檢出限與定量限

按照上述樣品檢測步驟，以產(chǎn)生儀器信噪比3倍響應(yīng)值所對應(yīng)濃度樣品進(jìn)行7次平行測定，計算測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按公式（1）計算方法檢出限和定量限，計算結(jié)果見表1。

由表1可知，該法中AFB1、CIT、OTA和ZEN 4種真菌毒素的檢出限分別為2.12、5.46、2.39和53.10 μg/kg，定量限分別為8.48、21.82、9.57和212.38 μg/kg。

2.4 ?方法精密度

以不同濃度水平的4種標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定7次，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，各毒素測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5，表明本方法精密度良好。

2.5 ?回收率分析

按照表3，在7份平行大米樣品中各添加3個水平的AFB1、CIT、OTA和ZEN標(biāo)準(zhǔn)品后，采用上述前處理和檢測方法進(jìn)行分析，其計算結(jié)果如表4所示。

在回收率分析中，加標(biāo)水平2為國家的限量標(biāo)準(zhǔn)[9]（CIT的限量值參考文獻(xiàn)[10]）。由上述結(jié)果可知，大米中AFB1、OTA和ZEN的回收率均大于80%，CIT的回收率在75%左右。在加標(biāo)水平3即高于國家限量標(biāo)準(zhǔn)（CIT參考輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2847-2007）條件下，大米中AFB1、CIT、OTA和ZEN的回收率均高于80%。7次平行測定的回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.22%～5.81%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.50%～6.00%，準(zhǔn)確度和精密度均可滿足同時對AFB1、CIT、OTA和ZEN的分析。

3 ?小結(jié)與討論

作為當(dāng)前真菌毒素檢測方法的研究熱點，多真菌毒素較之傳統(tǒng)單一毒素檢測方法，具有靈敏度高、通量大、周期短、成本低、重現(xiàn)性好等特點。目前，高通量真菌毒素檢測方法最多可同時檢測23種真菌毒素[11]，但這類方法僅被部分有條件的實驗室采用，目前難以推廣。隨著我國經(jīng)濟(jì)和科技水平的提高，高效液相色譜儀已成為我國各級實驗室的基本配備儀器，因此建立多真菌毒素的同時提取，同時檢測高效液相色譜檢測技術(shù)將有助于真菌毒素檢測技術(shù)在基層的推廣，保障食品安全。通過對已建立方法的檢出限、定量限、精密度和回收率分析，表明該方法可滿足稻米樣品中主要真菌毒素同時分析需求，可顯著檢測效率，有利于保障食品安全，具有較好的應(yīng)用前景。

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