HPLC法對細(xì)梗香草中槲皮素和山奈酚含量的測定

林貴兵，羅光明，許燕萍，沈安，謝安芮，劉勇

摘要：測定了細(xì)梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl.）中槲皮素和山奈酚含量。用甲醇加熱回流鹽酸水解法，薄層色譜對細(xì)梗香草提取液中槲皮素和山奈酚進(jìn)行定性檢驗(yàn);高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定細(xì)梗香草中槲皮素和山奈酚含量，色譜條件為ACI C18（250 mm×4.6 mm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為368 nm，柱溫為30 ℃。槲皮素在0.24～2.40 μg內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.000 3x-0.006 1，R2為0.997 8，平均回收率為95.91%;山奈酚在0.72～7.20 μg內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.000 2x+0.411 5，R2 為0.997 2，平均回收率為103.06%。細(xì)梗香草中槲皮素和山奈酚含量在分別為0.021%與0.065%。

關(guān)鍵詞： 細(xì)梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl.）;槲皮素;山奈酚;HPLC

中圖分類號：O657.7+2 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? 文章編號：0439-8114（2014）23-5848-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.057

細(xì)梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl.） 又名滿山香，為報(bào)春花科植物全草，具有清熱解毒、祛風(fēng)、止咳、調(diào)經(jīng)、寧神等功效，臨床主要用于感冒咳嗽、風(fēng)濕痹痛、氣管炎、哮喘、月經(jīng)不調(diào)、神經(jīng)衰弱等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，細(xì)梗香草具有解熱、抗病毒、抗腫瘤等作用。細(xì)梗香草中有效成分以黃酮和皂苷為主，還有有機(jī)酸、揮發(fā)油等[2-6]。呂武清等[7]對細(xì)梗香草藥材測定黃酮苷元山奈酚的含量為0.015%～0.085%。唐琍萍等[8]優(yōu)化了樣品處理方法同時(shí)測定槲皮素和山奈酚含量分別為0.006 1%和0.107 0%。因這些方法都采用層析柱對提取液黃酮苷元進(jìn)行了純化富集，其成分損失較大。本研究采用直接提取法，減少提取工藝對有效成分的損失，優(yōu)化提取過程，提高效率，節(jié)約成本，并用HPLC法測定細(xì)梗香草槲皮素、山奈酚含量，使結(jié)果更客觀準(zhǔn)確。本研究通過測定細(xì)梗香草全草中槲皮素與山奈酚含量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

1100型高效液相色譜儀（Agilent公司），配二極管陣列檢測器（DAD）;AB104-N型電子天平（德國Mettler-Toledo公司）;薄層色譜硅膠G（青島海洋化工有限公司）;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為去離子水。

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（批號：20130522，上海金穗生物科技有限公司）與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品（批號：110861-201209，中國食品藥品檢驗(yàn)研究院），藥材經(jīng)劉勇副教授鑒定為報(bào)春花科珍珠菜屬植物細(xì)梗香草（Lysumachia capillipes Hemsl.）的干燥全草（圖1）。

1.2 ?含水量測定

取細(xì)梗香草藥材，粉碎后過80目篩，精密稱取粉末2.0 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋至105 ℃干燥5 h，蓋好瓶蓋后移至干燥器中，冷卻30 min，再次精密稱定。再于105 ℃干燥1 h，冷卻后稱重，直至連續(xù)兩次稱重，重量差不超過5 mg，計(jì)算藥材中含水量（%）。

1.3 ?供試品制備

取細(xì)梗香草藥材全草同一批次粉末2.0 g，精密稱重置于具塞的玻璃瓶中，精密加入25 mL甲醇，精密稱重，置水浴中加熱回流1 h，冷卻后稱重，補(bǔ)足損失甲醇并混勻;過濾并取濾液10 mL，水浴蒸干，用20 mL甲醇溶解，加入2 mL濃鹽酸，置水浴中加熱回流水解1 h，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜后即為供試品溶液。

1.4 ?對照品制備

精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品2.4 mg，山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品7.2 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻溶解，濃度分別為槲皮素對照品（Q）0.24 μg/μL、山奈酚對照品（P）0.72 μg/μL，冷藏備用。

1.5 ?薄層色譜

取供試品、槲皮素與山奈酚對照品溶液10 μL分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸（5∶4∶1，V/V/V）為展開劑，置鹽酸蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干。

1.6 ?色譜系統(tǒng)考察

1.6.1 ?色譜條件 ?色譜柱為ACI C18（250 mm×4.6 mm）柱，流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為368 nm，柱溫為30℃。對照品進(jìn)樣量為20 μL。

1.6.2 ?線性關(guān)系考察 ?分別精密進(jìn)樣槲皮素與山奈酚混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、4、6、8、10 μL，在上述色譜條件下測定峰面積，將其含量與峰面積進(jìn)行處理。y表示含量，x表示峰面積;分別得到線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)。

1.6.2 ?精密度試驗(yàn) ?精密吸取樣品溶液20 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算槲皮素與山奈酚峰面積RSD值。

1.6.3 ?穩(wěn)定性試驗(yàn) ?精密吸取同一供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，在0、1、2、3、4、5 h測定槲皮素與山奈酚峰面積，分別計(jì)算其RSD值。

1.6.4 ?重復(fù)性試驗(yàn) ?取同一批樣品6份，制成供試品溶液，精密吸取20 μL，按上述色譜條件測定槲皮素和山奈酚峰面積，分別計(jì)算其RSD值。endprint

1.6.5 ?加樣回收率試驗(yàn) ?稱取2.0 g細(xì)梗香草藥材粉末，加入5 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“1.3”項(xiàng)操作下制成供試品溶液，每次吸取20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定和分析，分別計(jì)算槲皮素和山奈酚平均回收率和RSD值。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?含水量

按照2010版藥典規(guī)定的方法，對細(xì)梗香草全草含水量測定結(jié)果為12.43%。

2.2 ?薄層色譜結(jié)果

薄層色譜結(jié)果如圖2所示，可見在“1.5”條件下，山奈酚與槲皮素分離效果較好，說明“1.3”中供試品制備條件能提取并水解出山奈酚與槲皮素，展開系統(tǒng)合適分離山奈酚與槲皮素。

2.3 ?HPLC系統(tǒng)

線性關(guān)系考察結(jié)果表明，槲皮素在0.24～2.40 μg內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.000 3x-0.006 1，R2為0.997 8;山奈酚在0.72～7.20 μg內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.000 2x+0.411 5，R2為0.997 2。精密度試驗(yàn)表明，槲皮素與山奈酚RSD值分別為1.376%、0.367%，說明精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果其RSD值分別為1.51%、1.99%，表明在5 h內(nèi)樣品比較穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)中槲皮素的峰面積分別為2 014.3、2 039.1、2 068.6、2 022.3、2 040.0、2 016.8，山奈酚峰面積分別為11 310.9、11 353.1、11 869.9、11 386.6、11 933.0、11 481.2，其RSD值分別為1.00%、2.34%。加樣回收率結(jié)果槲皮素和山奈酚平均回收率分別為95.91%、103.06%;RSD值分別為 2.76%、1.12%，結(jié)果見表1。

2.4 ?對照品分離

在“1.6.1”色譜條件下，進(jìn)樣對照品結(jié)果（圖3）表明，槲皮素和山奈酚的保留時(shí)間分別為5.4 min和8.1 min，分離效果較好。

2.5 ?供試品HPLC圖譜

精密吸取供試品溶液20 μL，在“1.6.1”色譜條件下測定，色譜圖結(jié)果如圖4所示。

2.6 ?細(xì)梗香草槲皮素、山奈酚含量

本研究對藥材進(jìn)行了槲皮素與山奈酚含量的測定，結(jié)果槲皮素和山奈酚含量分別為0.021%和0.065%。

3 ?小結(jié)與討論

3.1 ?提取工藝方法

細(xì)梗香草主要有效成分包括黃酮類和皂甙類，以前學(xué)者研究黃酮類物質(zhì)主要采用了柱層析方法富集黃酮類成分，此方法除去了非黃酮類成分，但對黃酮類成分損失較大，本研究采用直接提取鹽酸水解法，損失相對較小，對含量測定相對較為客觀準(zhǔn)確。

在用60%、80%、100%甲醇分別進(jìn)行提取，結(jié)果表明純甲醇提取槲皮素、山奈酚提取率最高，水浴加熱時(shí)間比較了30、60、90 min提取效果，結(jié)果表明提取時(shí)間差異不顯著，本課題采用了用純甲醇與水浴加熱60 min。

藥材粉末粗細(xì)程度對含量測定的影響，比較了過100、80、60目篩以及粗粉比較，結(jié)果表明過100目與80目對有效成分提取含量差異不顯著，而60目以及更粗的粉末幾乎無法提取出黃酮類成分。因此對于細(xì)梗香草黃酮類有效成分提取藥材粉末至少要過80目篩。

3.2 ?色譜條件

呂武清等[7]測定山奈酚色譜條件;流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53，V/V）;流速：1.0 mL/min條件下，山奈酚在約8.6 min處出峰。唐琍萍[8]等測山奈酚與槲皮素的條件;流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（500∶500∶1，V/V/V） 條件下槲皮素在約9.4 min出峰，山奈素在約16.2 min有一色譜峰。本試驗(yàn)用色譜柱為ACI C18（250 mm×4.6 mm）柱，修改流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為368 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。在此色譜條件下，槲皮素和山奈酚的保留時(shí)間分別為5.4 min和8.1 min，縮短了出峰時(shí)間，提高了效率，節(jié)約了試驗(yàn)成本。

3.3 ?小結(jié)

細(xì)梗香草中皂苷類成分研究比較清楚，而黃酮類成分研究不多，在藥材中它主要以黃酮苷的形式存在，水解為黃酮苷元后，藥材化學(xué)成分特異性不強(qiáng)，需進(jìn)一步深入研究黃酮類化學(xué)成分。細(xì)梗香草葉的黃酮類成分含量比莖高，具有顯著差異，這也與采收期密切相關(guān)，因此本課題組下一步研究細(xì)梗香草不同采收期藥材的含量差異，其成分動(dòng)態(tài)積累的規(guī)律，研究其最佳時(shí)間，為細(xì)梗香草質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

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