神經(jīng)肽Y對小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株N9細(xì)胞分泌TNF-α的影響

吳永波李琦軍0500石家莊市公安局法醫(yī)損傷檢驗鑒定室050000石家莊市第三醫(yī)院創(chuàng)傷一科

神經(jīng)肽Y對小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株N9細(xì)胞分泌TNF-α的影響

吳永波1李琦軍2
050011石家莊市公安局法醫(yī)損傷檢驗鑒定室1
050000石家莊市第三醫(yī)院創(chuàng)傷一科2

目的：探討神經(jīng)肽Y對小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生成TNF-α的影響。方法：以Elisa方法檢測培養(yǎng)液中TNF-α蛋白含量，以RT-PCR方法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-αmRNA表達(dá)水平。結(jié)果：孵育各組N 9細(xì)胞6 h后，LPS組培養(yǎng)液中TNF-α蛋白的含量及N 9細(xì)胞中TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著高于Control組(P＜0.05)；LPS+NPY組TNF-α蛋白含量和mRNA表達(dá)水平與LPS組相比，顯著降低(P＜0.05)；IBP 3226+NPY+LPS組IL-1β蛋白含量和mRNA表達(dá)水平與LPS+NPY組相比，顯著增高(P＜0.05)。結(jié)論：NPY通過作用于NPY Y1受體降低小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞N 9的生物活性，抑制其生成TNF-α。

神經(jīng)肽-Y；小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；TNF-α

小膠質(zhì)細(xì)胞巨噬細(xì)胞的一種，它的主要分布部位在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要參與免疫反應(yīng)。MG還是大腦中產(chǎn)生炎癥因子的主要細(xì)胞之一，當(dāng)受到刺激后，MG成活化狀態(tài)，可釋放白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子以及活性氧、脂類等大量生物活性物質(zhì)[1]，這些活性物質(zhì)的過分釋放會導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。神經(jīng)肽Y(NPY)是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的多肽，在神經(jīng)元受到損傷時能夠起到保護(hù)神經(jīng)元的作用[2]。本實驗中，我們采用經(jīng)典激活劑LPS激活小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞N9細(xì)胞，檢測其分泌的TNF-α的影響，與提前用NPY處理后的N9作對比，觀察NPY是否能夠降低N9的TNF-α的分泌水平。

資料與方法

N9細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察：復(fù)蘇N9細(xì)胞，置于25 cm2培養(yǎng)瓶，用含10％血清的DMEM，培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔日換液，至細(xì)胞鋪滿瓶底后傳代，供實驗用。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定：N9細(xì)胞接種于內(nèi)置預(yù)涂多聚賴氨酸蓋玻片的培養(yǎng)板，培養(yǎng)3 d后取出蓋玻片，IBA-1抗體熒光染色，封片后熒光顯微鏡觀察N9細(xì)胞形態(tài)。

N9細(xì)胞分組及處理：以1×105/mL的濃度將N9細(xì)胞種于預(yù)鋪多聚賴氨酸的六孔板內(nèi)，3mL/孔，培養(yǎng)3 d后換新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)孵育12 h，將各孔隨機(jī)分為五組。CON組為正常對照組，以無血清培養(yǎng)基孵育N9細(xì)胞6 h，LPS組是以含終濃度為100 ng/mL LPS的無血清培養(yǎng)基孵育N9細(xì)胞6 h，NPY+LPS組是先以含NPY的無血清培養(yǎng)基孵育N9細(xì)胞半小時，然后加入LPS繼續(xù)孵育6 h，NPY組是以含NPY(終濃度1μM)無血清培養(yǎng)基孵育N9細(xì)胞6 h，BIBP 3226+NPY+ LPS組先用含NPYY1受體阻滯劑BIBP 3226的無血清培養(yǎng)基孵育N9細(xì)胞半小時[3]，余步驟同NPY+LPS組。6 h后用ELISA法檢測培養(yǎng)基中TNF-α的含量。六孔板中的N9細(xì)胞留作PCR檢測用。

各組培養(yǎng)液中TNF-α蛋白含量的測定：按照Elisa試劑盒說明書進(jìn)行操作，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度[4]。

各組N9中TNF-αmRNA表達(dá)水平的測定：采用實時熒光定量PCR法檢測上述各組小膠質(zhì)細(xì)胞中的TNF-αmRNA表達(dá)水平。

統(tǒng)計學(xué)處理：利用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性的要求，采用重復(fù)測量資料的方差分析，數(shù)據(jù)以(x±s)表示，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

N9及原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：N9細(xì)胞經(jīng)IBA-1染色后，可見N9細(xì)胞被染成紅色。用不同培養(yǎng)液孵育N9 6 h后，觀察培養(yǎng)液中TNF-α蛋白含量的變化。各組孵育N9 6 h后，LPS組和IBP3226+NPY+LPS組培養(yǎng)液中TNF-α的含量顯著高于CON組(P＜0.01)；但LPS組和IBP3226+NPY+LPS組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LPS+NPY組比LPS組TNF-α的含量明顯降低(P＜0.01)，IBP3226+NPY+LPS組與LPS+NPY組相比，TNF-α的含量顯著增高(P＜0.01)，NPY組與對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明NPY明顯抑制了LPS導(dǎo)致的TNF-α的升高，這種效應(yīng)可以被BIBP 3226阻斷，NPY本身對N9生成TNF-α的量沒有明顯影響。

不同培養(yǎng)液孵育N9 6 h后，N9中TNF-αmRNA水平的變化：各組孵育N9 6 h后，LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組中N9的TNF-αmRNA水平顯著高于CON組(P＜0.01)；但LPS組和BIBP3226+ NPY+LPS組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LPS+NPY組比LPS組MG的TNF-α mRNA水平明顯降低(P＜0.01)，IBP 3226+NPY+LPS組與LPS+NPY組相比，MG的TNF-α的mRNA水平顯著增高(P＜0.01)，NPY組與對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果說明，LPS可以明顯提高M(jìn)G的TNF-αmRNA水平，NPY可以抑制LPS的作用，BIBP 3226阻斷NPY Y1受體后，NPY的作用消失。NPY對N9細(xì)胞的TNF-αmRNA水平?jīng)]有影響。

討論

本實驗采用LPS為N9細(xì)胞的激活劑，在LPS處理N9細(xì)胞6 h后，N9細(xì)胞的免疫活性也隨之增強(qiáng)，N9細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α明顯增高，而對照組中未發(fā)現(xiàn)較大的變化，兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。LPS可以激活N9細(xì)胞，該過程可以受到多種因素的影響，而其中NPY可以明顯地抑制激活過程，從而使N9細(xì)胞的激活減少，降低其產(chǎn)生TNF-α蛋白的量，并且能夠大大降低TNF-αmRNA表達(dá)水平，NPY Y1受體會受到BIBP 3226的影響，對該受體產(chǎn)生阻斷作用，會使得NPY對LPS激活N9細(xì)胞的抑制作用完全消失，該結(jié)果說明NPY對LPS激活N9細(xì)胞的抑制作用都是通過Y1受體產(chǎn)生的[5]。本研究表明NPY對靜止期的小膠質(zhì)細(xì)胞影響不大[6]。NPY對小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫活性有調(diào)節(jié)作用，能下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫活性[7]，抑制TNF-α的產(chǎn)生，這種作用是通過其Y1受體實現(xiàn)的。本研究為NPY以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶點治療與炎癥有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實驗依據(jù)。

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Effectof neuropeptide Y on the secretion of TNF-αbym icroglia cell line N9 cellsofmouse

Wu Yongbo1,LiQijun2
Forensic Damage Inspection and Identification Room ofPublic Security Bureau ofShijiazhuang City 0500111
The FirstDepartmentofTrauma,the Third HospitalofShijiazhuang City 0500002

Objective：To explore the effect of neuropeptide Y on the secretion of TNF-αbymicroglia cells.Methods：The content of TNF-αin the culturemedium was detected by Elisamethod,and the expression levelof TNF-αmRNA inmicroglia cellswas detected using RT-PCRmethod.Results：After 6 hours of hatching N9 cells in all groups,the content of TNF-αin the culture medium of LPSgroup and the expression levelof TNF-αmRNA in N9 cellswere significantly higher than the controlgroup(P＜0.05).Compared with LPSgroup,in the LPS+NPY group,the content of TNF-αand the expression level of TNF-αmRNA were significantly lower(P＜0.05).Compared with LPS+NPY group,in the IBP 3226+NPY+LPS group,the content of IL-1βprotein and the expression level ofmRNA were significantly increased(P＜0.05).Conclusion：NPY reduced the biological activity of N9 of microglia cells through the effect of NPYY1 receptor,and inhibited the formation of TNF-α.

Neuropeptide-Y；Microglia cells；TNF-α

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.36.2