氯氰菊酯降解菌DZS—3的分離鑒定及其特性

馬婷，李存治，毛靈琪，單風娟，閆達中

摘要：以氯氰菊酯為惟一碳源與氮源，從生產(chǎn)氯氰菊酯的農(nóng)藥廠污水曝氣處理池的活性污泥樣品中，通過富集馴化和劃線分離，篩選出一株氯氰菊酯的高效降解菌DZS-3。經(jīng)氣相色譜檢測，3d內(nèi)其對氯氰菊酯的降解率為65.7%。形態(tài)學觀察，該菌圓形，周邊光滑，革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陰性菌。通過16S rDNA序列分析及生理生化特性鑒定，將其初步鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬的一種（Stenotrophomonas sp.）。

關(guān)鍵詞：氯氰菊酯降解菌;篩選;鑒定;寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）

中圖分類號：X172;Q93-331 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5708-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.022

擬除蟲菊酯類（Synthetic Pyrethroids）殺蟲劑是一類具有優(yōu)異生物活性、環(huán)境相容性較好的農(nóng)藥，它是繼有機磷、有機氯和氨基甲酸酯之后發(fā)展起來的一類殺蟲劑[1]。該類殺蟲劑是模擬植物源農(nóng)藥——天然除蟲菊酯合成的一類含有多個苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化學農(nóng)藥[2，3]。

氯氰菊酯是擬除蟲菊酯類殺蟲劑中的一種，具有高效、廣譜、低毒等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于果樹、蔬菜的病蟲防治，但其在環(huán)境中有一定的蓄積性，很難在自然條件下快速降解。氯氰菊酯的廣泛使用，造成了其在農(nóng)產(chǎn)品上的大量殘留和土壤、河流的污染，給生態(tài)環(huán)境和人類自身的健康安全帶來了極大的威脅。農(nóng)藥殘留是影響我國農(nóng)產(chǎn)品出口的重要屏障，農(nóng)藥殘留超標勢必給我國的經(jīng)濟造成極大的損失。雖然國內(nèi)外關(guān)于處理擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的方法有很多的報道，但都不能從根本上消除農(nóng)藥殘留的問題。如何有效地解決菊酯類農(nóng)藥殘留的問題，成為當前人們面臨的一大難題。殘留在環(huán)境中的氯氰菊酯可以通過光降解、化學降解以及微生物的作用被降解。而與化學降解和光降解等方式相比較而言，農(nóng)藥的微生物降解具有安全、高效、費用低、無二次污染等優(yōu)點，所以，以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)是一種環(huán)境友好型污染物消除技術(shù)，也是去除氯氰菊酯殘留的一種有效的手段。本研究旨在于分離篩選出新的高效降解氯氰菊酯的菌株，檢測其對氯氰菊酯的降解能力，探討直接用于氯氰菊酯引起的環(huán)境污染的微生物修復(fù)的可能性。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?主要儀器設(shè)備 ?自動凝膠成像分析儀，PCR 擴增儀，電泳儀，全自動高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫搖床，超凈工作臺，顯微鏡，生化培養(yǎng)箱，紫外-可見分光光度計（PE Lambda 25），氣相色譜儀（Agilent）。

1.1.2 ?采集樣品 ?從江蘇某農(nóng)藥廠曝氣池排污口附近土壤采集樣品。

1.1.3 ?試劑 ?K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、NaCl、氯仿、環(huán)己烷均為分析純，瓊脂，牛肉浸取物，胰蛋白胨（Tryptone），酵母提取物（Yeast extract），氯氰菊酯原藥（純度94%）（氯氰菊酯原藥使用前先用乙醇或正己烷配成高濃度母液，并過濾除菌）。

1.1.4 ?擴增16S rDNA 引物 ?primer 27F： 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; primer 1492R： 5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.1.5 ?培養(yǎng)基

1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0 g，去離子水1 L。

2）增菌富集培養(yǎng)基：蛋白胨 2.0 g，NaC1 1.0 g，牛肉膏 1.0 g，去離子水 l L，pH 7.0～7.2。

3）LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g，Yeast extract 5 g，Tryptone 10 g，去離子水 l L，pH 7.0。

往上述培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉即為固體培養(yǎng)基。

1.2 ?方法

1.2.1 ?氯氰菊酯降解菌的分離純化 ?稱取污泥5 g，加入滅菌的裝有100 mL去離子水的三角燒瓶中，170 r/min、30 ℃，在搖床上振蕩1周，充分釋放污泥中的微生物[4]，然后將上清液5 mL和曝氣池液體5 mL加入到含氯氰菊酯濃度為50 mg/L的100 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在搖床上30 ℃、170 r/min培養(yǎng)。按3%的接種量，每7 d轉(zhuǎn)接1次，每轉(zhuǎn)接1次氯氰菊酯濃度提高50 mg/L，直到氯氰菊酯濃度為250 mg/L。交替使用乙醇和正己烷溶解氯氰菊酯以消除溶劑對試驗的干擾，確保篩選出的菌株能夠利用氯氰菊酯農(nóng)藥作為惟一碳源、氮源生長。取菌液按100，10-2 ，10-4，10-6 進行做4個梯度的稀釋（每個梯度設(shè)3個重復(fù)）后涂布于含氯氰菊酯的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出菌落后，按照菌落形態(tài)、大小、顏色不同挑取單菌落在含氯氰菊酯的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上劃線分離，純化菌株，直到得到單一、均勻的單菌落。

1.2.2 ?紫外分光光法初步鑒定高效降解菌株 ?將篩選得到的生長良好的單菌落接入3 mL液體富集培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min搖床過夜培養(yǎng)。按3%的接種量將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到含100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)至OD600 nm=0.6左右，7 000 r/min、5 min離心收集菌體。并用磷酸緩沖液洗兩次。用磷酸緩沖液懸浮菌體，并調(diào)OD600 nm=1.0。按3%的接種量接種到5瓶10 mL的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（氯氰菊酯濃度為100 mg/L）培養(yǎng)，以不加菌為對照，1、3 d 取樣，每個樣做3個重復(fù)，以三氯甲烷為萃取劑雙倍體積萃取。三氯甲烷萃取后用紫外可見分光光度計于200～700 nm波長下掃描確定氯氰菊酯的特征吸收峰，檢測氯氰菊酯的降解情況，以確定降解效果最好的菌株。

1.2.3 ?高效降解菌株降解率的確定 ?將降解效率最高的菌株按與“1.2.2”基本相同的步驟操作，其中氯氰菊酯的含量為10 mg/L，取樣點為1 、3 、5 、7 、9 d。最后用環(huán)己烷雙倍體積萃取氯氰菊酯，無水硫酸鈉除去樣品中的水，每個樣做3個重復(fù)，用氣相色譜檢測氯氰菊酯的含量。

氣相色譜條件[5]：氣相色譜儀為7 890A（帶工作站），載氣：99.999%N2，平均線速度：65 cm/L，不分流進樣，進樣量為1 μL ，毛細管柱（30 mm×0.53 mm× 1.5 μm）。進樣口溫度為250 ℃，ECD檢測器，檢測器溫度為300 ℃，柱溫采用程序升溫：初溫為150 ℃升溫至280 ℃，在此溫度保持10 min。

1.2.4 ?高效降解菌生長曲線的繪制 ?將對氯氰菊酯降解率最高菌株富集后按1%的接種量接種到含0.01%的Yeast extract的液體基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min培養(yǎng)，0、1、3、5、7 、9 d取樣，測定其相應(yīng)的OD600 nm，以培養(yǎng)時間為橫坐標，菌液OD600 nm為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.5 ?氯氰菊酯降解菌的鑒定

1）染色。常規(guī)染色觀察菌株的形態(tài)學特征，革蘭氏染色檢測參照文獻[6]。

2）16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析。將菌體接種到富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，取100 μL菌液離心，用滅菌水洗兩遍，再用100 μL滅菌水懸浮菌體，沸水中煮10 min，再放置冰上5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清作為模板直接PCR。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：rTaq 酶（5 U/μL） 0.2 μL，10×PCR buffer（Mg2+ Plus）2.5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，上清液 2 μL，上游引物 0.3 μL，下游引物 0.3 μL，滅菌水 17.7 μL。

PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min30 s，30個循環(huán);72 ℃ 8 min。

將PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，將條帶單一，清晰的PCR產(chǎn)物切膠回收。將回收片段與pGEM–T Easy載體于4 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞。隨即挑取幾個轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒，酶切檢測。將含有目的條帶的轉(zhuǎn)化子送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

3）生理生化鑒定。為明確菌株的生理生化特性，對菌株作了以下試驗：碳源利用試驗，產(chǎn)酸試驗，產(chǎn)H2S試驗，淀粉水解試驗，甲基紅試驗，明膠液化試驗，V.P.試驗，吲哚試驗。試驗方法參照文獻[6]。

1.2.6 ?菌株對抗生素的敏感性 ?將菌株用富集培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取10 μL接入含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，觀察菌株在抗生素種類和濃度的敏感性。其中，抗生素的濃度分別為氨芐青霉素60 、20、10 μg/mL;卡那霉素50、10、2 μg/mL;鏈霉素50、10、2 μg/mL;氯霉素100、25、5 μg/mL。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?氯氰菊酯降解菌的篩選

從生產(chǎn)氯氰菊酯的工廠附近采集樣品，以氯氰菊酯為惟一碳源、氮源篩選具有降解農(nóng)藥能力的微生物。通過在含有氯氰菊酯的無機鹽培養(yǎng)基中反復(fù)馴化以及無機鹽平板上多次劃線分離、純化，初步得到9株降解氯氰菊酯的菌株。為維持降解菌降解能力的穩(wěn)定性，后經(jīng)進一步的復(fù)篩，將篩選得到的9株降解菌經(jīng)過擴大培養(yǎng)、涂布含氯氰菊酯的無機鹽平板，得到3株生長良好的降解菌。經(jīng)紫外掃描分析，氯氰菊酯在278 nm處有最大吸收峰，確定一株高效降解氯氰菊酯的菌株，命名為DZS-3。圖1為3 d內(nèi)菌株DZS-3對氯氰菊酯降解情況及對照的紫外掃描圖。

2.2 ?DZS-3對氯氰菊酯的降解率及降解趨勢

氯氰菊酯降解率=[1-（實測殘量/對照樣實測殘量）]×100%[7]。

氣相色譜的靈敏度較高，為精確計算高效降解菌DZS-3的降解率，實驗室用氣相色譜檢測了氯氰菊酯的含量。氯氰菊酯經(jīng)DZS-3作用3 d后，DZS-3對氯氰菊酯的降解率為65.7%。圖2為經(jīng)氣相色譜檢測，DZS-39在9 d內(nèi)對氯氰菊酯的降解情況。

由圖2可以看出，前3 d DZS-3對氯氰菊酯的降解速率較快，3 d后降解逐漸變緩慢?？赡苁锹惹杈挣ピ诮到獾倪^程中產(chǎn)生了對其自身降解有抑制作用的中間產(chǎn)物。

2.3 ?高效降解菌生長曲線

該菌體的生長曲線（圖3）與常規(guī)的生長曲線不同，一般生長曲線包括滯后期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期，而該菌的生長曲線沒有穩(wěn)定期?？赡苁锹惹杈挣ピ诮到獾倪^程中產(chǎn)生了某些嚴重抑制DZS-3生長的代謝產(chǎn)物，使菌體細胞迅速死亡裂解。

2.4 ?氯氰菊酯降解菌的鑒定

2.4.1 ?氯氰菊酯降解菌DZS-3的形態(tài)特征 ?通過簡單染色、革蘭氏染色等生物學技術(shù)初步鑒定DZS-3降解菌的形態(tài)特征。菌落為針尖狀，表面光滑，無顏色，有輕微的氣味，顯微鏡下形狀呈短桿狀。經(jīng)革蘭氏染色鑒定，DZS-3為革蘭氏陰性菌。

2.4.2 ?16S rDNA同源性比較 ?為了確定降解菌的種類，采用比較常用的分類學指標——16S rDNA序列同源性比較。

通過菌落PCR擴增16S rDNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小如圖4所示。將擴增得到的16S rDNA片段的測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進行對比，菌株DZS-3與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌PSM-2的16S rDNA一致性達到99%，將其初步鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬的一種。

應(yīng)用序列比對軟件ClustalX 1.8軟件對菌株的16S rDNA序列與相似性較高的16S rDNA序列進行比對，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件Mega 5.03構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，DZS-3系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖5。

2.4.3 ?DZS-3生理生化特性 ?DZS-3生理生化實驗結(jié)果見表1。表1結(jié)果與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的模式菌株ATCC13637的特性除少數(shù)不同外基本上一致，模式菌株不能產(chǎn)酸，可以液化明膠，DZS-3可以產(chǎn)酸但不能液化明膠。

2.5 ?菌株對抗生素的敏感性

為明確DZS-3對各種抗生素的敏感性，對氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素、氯霉素等4種抗生素做了抗性試驗。每種抗生素做了3個不同濃度梯度， DZS-3在加有不同濃度抗生素氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素的LB培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，但是在氯霉素中不能生長。表明DZS-3在試驗濃度內(nèi)對氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素都有抗性，對氯霉素敏感。由于DZS-3對多種抗生素具有抗性，這將影響其以后在環(huán)境中釋放和應(yīng)用。

3 ?討論

氯氰菊酯在水中的溶解度非常低（大約0.1 mg/L），所以氯氰菊酯在使用前通常將其溶解在有機溶劑（如乙醇、正己烷）中以增加其溶解度。在篩選降解菌的過程中為防止篩選到的降解菌利用溶劑為碳源、氮源生長，采用乙醇和正己烷交替使用。通過反復(fù)的初篩和復(fù)篩，從生產(chǎn)氯氰菊酯的農(nóng)藥廠污水曝氣處理池活性污泥中分離篩選一株氯氰菊酯的高效降解菌DZS-3，通過氣相色譜分析其3 d內(nèi)對10 mg/L的氯氰菊酯的降解率為65.7%。經(jīng)形態(tài)學研究及革蘭氏染色，該菌屬于革蘭氏陰性菌，菌落為針尖狀，表面光滑，顯微鏡下呈短桿狀。經(jīng)16S rDNA序列同源性分析及生理生化特性鑒定，將其鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬的一種。

在對降解菌初篩時，采用紫外-可見分光光度法測定氯氰菊酯的含量，以氯仿為萃取劑，而氯仿本身對細胞膜有一定的破壞作用，在氯仿的作用下導(dǎo)致降解菌DZS-3細胞膜的破損，細胞內(nèi)容物如蛋白質(zhì)等滲透出來，被氯仿萃取出來，同時蛋白質(zhì)的特征吸收峰在280 nm，與氯氰菊酯的特征吸收峰278 nm靠得很近，蛋白質(zhì)的存在可能會影響氯氰菊酯的特征吸收，故使用分光光度儀只能粗略判定氯氰菊酯的降解情況。氣相色譜靈敏度較高，測定的數(shù)據(jù)能真實反映物質(zhì)的含量，要精確計算氯氰菊酯的降解率需采用氣相色譜法準確測定氯氰菊酯的含量。

國內(nèi)報道的氯氰菊酯降解菌株主要有紅球菌（Rhodococcus sp.）[5]，假單胞菌（Pseudomonas sp.）[8，9，10，11]，腸桿菌Enterobacter sp.[9]，中華根瘤菌（Sinorhizobium sp.）[12]，克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）[13]，芽孢桿菌（Bacillius sp.）[14]，產(chǎn)堿菌（Alcaligenes sp.）[15]，Starkeya sp.[16]，蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）[17]。國外報道的氯氰菊酯的降解菌株P(guān)seudomonas sp.和Serratia sp. 20 d的降解率只有50%[18]，明顯低于本研究分離的菌株DZS-3，分離篩選的這株菌屬于寡養(yǎng)單胞菌屬，大多屬于不可培養(yǎng)微生物，與上述各個實驗室報道的氯氰菊酯降解菌不同。菌株DZS-3對多種抗生素具有抗性，所以不能直接釋放入環(huán)境用于污染環(huán)境的修復(fù)，但可以作為出發(fā)菌株研究氯氰菊酯降解相關(guān)酶基因，并且有可能克隆得到新的降解基因。

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