微生物油脂提取技術的研究進展

鐘 琦，吳慧昊，代軍飛，牛 鋒*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 理科實驗中心，甘肅 蘭州 730124）

能源作為現(xiàn)代工業(yè)的支柱，是國民經(jīng)濟發(fā)展的動力。隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活水平的日益提高，世界各國對能源的要求不斷向著經(jīng)濟、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展的方向努力。微生物油脂（microbial oils）又稱為單細胞油脂（single cell oil，SCO），即酵母菌、霉菌、細菌和藻類等產油微生物在一定條件下，利用碳水化合物、碳氫化合物和氨基酸等分別作為碳源和氮源，輔以無機鹽，在菌體內產生的大量油脂[1]。產油微生物能夠高效利用碳水化合物合成微生物油脂，并且大部分微生物油脂可以替代動植物油脂產生生物柴油，從而緩解能源危機[2]。因此，微生物油脂作為可再生的綠色能源和功能性油脂，已經(jīng)得到越來越多的關注。微生物生產油脂具有眾多優(yōu)點[3-4]：（1）微生物生長周期短，適應性強，代謝旺盛，培養(yǎng)簡單；（2）微生物易于遺傳物質的改良，能大幅度提高產量的同時，還能得到符合人類需要的功能性脂肪酸，如二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、γ-亞麻酸（gamma linolenic acid，GLA）等；（3）微生物生產油脂可利用農副產品、食品加工的廢棄物作為培養(yǎng)基原料，有利于廢棄物的再利用和環(huán)境保護；（4）微生物油脂生物安全好，毒副作用?。唬?）微生物生產油脂不受場地和季節(jié)限制，能夠連續(xù)大規(guī)模工業(yè)化生產；（6）微生物比高等植物更能有效地積累油脂。

油脂提取技術是決定微生物油脂能否廣泛應用的重要因素之一。因此，研究油脂提取相關工藝技術及方法具有重要的應用價值。本文重點對油脂提取技術進行分類介紹，并對其發(fā)展趨勢進行分析。

1 微生物油脂的組成特點

微生物油脂主要由多不飽和脂肪酸組成，包括亞油酸（leinoleic acid，LA）、γ-亞麻酸、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸等[5]。這些不飽和脂肪酸對人類的健康具有重要的生理作用，如LA不僅對癌癥、粥狀動脈硬化具有一定的防治作用，還能參與脂肪的新陳代謝，增強免疫[6]；GLA對粥樣動脈硬化、血栓性心腦血管和腫瘤具有預防作用，還對消炎殺菌、降血脂和糖尿病具有一定的療效[7]；ARA對脂蛋白代謝、血管彈性、白細胞功能、血小板激活等具有重要的調節(jié)作用[8]；DHA具有健腦益智、促進神經(jīng)系統(tǒng)和視覺發(fā)育、防治心血管疾病和調節(jié)免疫等功能[9]。

多不飽和脂肪酸對人體免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)都具有重要而廣泛的生理功能。同時，全球性能源短缺及環(huán)境惡化使得微生物油脂廣泛應用于醫(yī)藥、食品和生物能源等方面。

2 國內外微生物油脂研究現(xiàn)狀

國外對微生物油脂的研究工作已有半個多世紀。在20世紀80年代末，英國和日本首先推出含GLA的微生物油脂的功能性飲料、醫(yī)療保健食品和高級化妝品[10]。目前，美國、日本和歐洲等國家已有微生物油脂面市。

我國對微生物油脂產業(yè)的研究相對較落后，大部分研究還處于實驗室或者中試階段。趙春海[11]用菊芋根塊水解液分批補料發(fā)酵膠紅酵母，其生物量為19.47 g/L，油脂含量達52.2%?？紫槔騕12]利用葡萄糖和木糖混合發(fā)酵培養(yǎng)斯達油脂酵母，其生物量為15.8 g/L，油脂含量達58.8%。余增亮等[13]在4×200 m3大容器反應器中發(fā)酵由離子束誘變的高山被孢霉，其生物量達38.2 g/L，油脂含量20.67 g/L。提取花生四烯酸后的殘油，經(jīng)過精煉后，還能作為生物柴油。

3 微生物油脂的生產工藝

工業(yè)微生物油脂的生產工藝[14]：

篩選菌種→活化菌種→一級種子液→二級種子液→發(fā)酵罐生產→收集菌體→菌體預處理→油脂提取→油脂產品的制備

工業(yè)化大規(guī)模生產微生物油脂的菌株必須具備[15]：（1）具有合成油脂的能力，且油脂積累量大；（2）能進行工業(yè)化深層培養(yǎng)；（3）食用安全；（4）生長速度快；（5）油脂易于提取。通過物理、化學和生物誘變等技術改變菌體遺傳物質，篩選功能性脂肪酸的高產菌株，已經(jīng)成為產油微生物定向育種的重要方向。

微生物油脂屬于胞內產物，對菌體的預處理是提取微生物油脂的關鍵步驟之一。微生物具有致密的細胞壁結構，在油脂提取前需要對菌體細胞進行預處理。預處理的方法包括：摻沙共磨法、菌體自析法、酸熱法、酶解法、超聲波法、反復凍融法和微波法等。預處理菌體細胞，可以使油脂更容易的萃取，縮短萃取時間和成本。

4 微生物油脂的提取方法

4.1 超臨界CO2萃取法（supercritical CO2fluid extraction）

以CO2為超臨界流體，利用其強溶解性、高擴散性、低黏性，良好的流動性和擴散性等特點，通過調整CO2的溫度和壓力，可以選擇性的進行油脂提取[16]。利用超臨界CO2萃取的油脂，不僅具有純度高、色澤好、無有機溶劑的殘留、無污染等優(yōu)點[17]，而且能選擇性的分離不飽和脂肪酸，并保持其生物活性[5]。因此，超臨界CO2萃取法是目前常用的微生物油脂提取技術。

王錦秀等[18]采用超臨界CO2萃取法，以微藻粉為原料，在萃取壓力30 MPa，萃取溫度35 ℃和萃取時間180 min的條件下，最大得油率在8%以上。王莉娟等[19]在壓力20 MPa，時間120 min和提取溫度40 ℃的條件下萃取被孢霉油脂，最大油脂得率為46.08%。

4.2 有機溶劑萃取法（organic solvent extraction）

根據(jù)相似相溶原理，油脂易溶于非極性有機溶劑，如氯仿、乙醚和石油醚等溶劑，通過長時間浸泡，將油脂提出。常用的有機溶劑萃取法有氯仿-甲醇法和乙醚-石油醚法。有機溶劑萃取法具有操作方法簡單、所需設備簡單和得油率高的優(yōu)點，但是油脂成分純度較低。

蒿珍珍[20]先用鹽酸疏松皮狀絲孢酵母的細胞壁，在沸水浴和速冷的條件下破壞細胞壁，以氯仿-甲醇作為萃取溶劑，獲得最大油脂得率為32.2%。孫曉璐等[21]采用酸熱法破碎細胞，分別以乙醚-石油醚、氯仿-甲醇作為萃取溶劑，結果顯示前一方法提取效果優(yōu)于后者，其油脂得率達29.8%。GALAFASSI S等[22]以未解毒的玉米秸稈水解液作為培養(yǎng)基，采用恒定細胞破碎系統(tǒng)破碎紅酵母，再用乙烷∶異丙醇（3∶2）提取油脂，其油脂含量為0.21 g/L，油脂得率為34%。

4.3 索氏抽提法（Soxhlet extraction method）

索氏抽提法作為脂肪提取的經(jīng)典方法，是利用乙醚等低熔沸點的有機溶劑長時間重復回流，將干菌細胞中油脂全部提出，是實驗室常用的油脂提取方法。雖然提取比較充分，但是耗時長，樣品處理量少。除了脂溶性脂肪外，還能將磷脂、脂肪酸、固醇和芳香油等提出，使得得到的油脂含量比實際油脂含量偏高[23]。ZHU M等[24-25]都通過試驗證明干菌得油率明顯高于濕菌得油率。

張鵬鵬[23]提取深黃被孢霉油脂時，得到索氏抽提法在產油量和油脂得率方面均明顯高于酸熱法，其產油量達6.81 g/L，油脂得率為53.47%。趙春海[11]利用發(fā)酵罐分批補料培養(yǎng)膠紅酵母菌株，用索氏抽提法提取細胞油脂，其生物量達19.47 g/L，油脂得率為52.21%。

4.4 酸熱法（acid-hot method）

酸熱法主要是利用酸將由糖和蛋白質等組成的細胞壁結構變得疏松，再在沸水浴和速冷的作用下進一步破壞細胞壁，從而有利于油脂提取。酸熱法將破碎細胞和油脂提取結合，提高了油脂提取能力，操作簡單、快速，對設備要求不高，且在短時間內可以處理大量樣品。

耿青偉[26]比較了不同提取方法對斯達油脂酵母提取油脂效果的影響，結果顯示，以酸熱法提取油脂的得油率最高，其最高油脂得率為21.36%?？追裁舻萚27]通過酸熱法對油脂酵母提取條件進行研究，確定每0.5 g干菌體用10 mL 4 mol/L鹽酸沸水浴8 min，再加入10 mL無水乙醇和24 mL乙醚∶石油醚（1∶1），最高油脂提取率為39.87%。

4.5 酶解輔助萃取（enzymatic assisted extraction）

酶解輔助萃取法是利用微生物細胞壁成分的差異，用不同的酶破壞細胞壁，再將油脂提出。蝸牛酶、纖維素酶和溶菌酶是實驗室常用于破壞細胞壁的酶。利用酶解處理細胞壁，具有操作簡便，條件溫和，不會破壞細胞原有的特定油脂成分。

王莉等[25]研究不同油脂提取工藝對產油酵母油脂產率的影響，結果顯示，先用10 mg/mL蝸牛酶破碎產油酵母JM-D的細胞壁，再用有機溶劑進行油脂提取的方法最好，最高油脂得率為46.2%。張秋紅[28]利用纖維素酶，在pH 4.10，酶解溫度37.9 ℃，酶用量0.16%和酶解1.86 h的條件下破壞眼點擬微綠球藻細胞壁，再進行油脂提取，其油脂提取率達（38.69±0.15）%。

4.6 超聲波輔助萃?。╱ltrasonic assisted extraction）

超聲波輔助萃取是利用超聲波對媒介產生機械振動作用和空化作用，以達到破碎細胞的一種物理破碎方法[29]。超聲波破碎細胞的方法簡單，且提取率較高。在使用超聲波輔助萃取時，需要控制細胞密度，否則會影響細胞的破碎效果[30]。

王敏等[31]采用酸熱耦合超聲波提取粘紅酵母油脂時，在提取液比1.9∶1，酸處理34 min，超聲波處理7.5 min的條件下，使1 g濕菌的油脂質量從42 mg增加至57.33 mg，油脂提取率提高了36.5%。馬千然[32]在超聲波功率1 680 W時，超聲處理Y3小球藻細胞15 min，再用有機溶劑萃取，其濕菌體的油脂產量達13.2%。

4.7 反復凍融輔助萃取（repeated freeze-thaw extraction）

反復凍融法是指將待破碎的細胞在-20 ℃條件下迅速冷凍，然后放于室溫或更高溫度迅速融化，如此反復多次，細胞內形成的冰晶使細胞液的鹽濃度增高而引起細胞破碎的方法。操作簡單，成本低，可以高密度大規(guī)模的提取微生物油脂，但是操作過程比較長，耗費人力。

王莉等[25]將產油酵母菌的菌懸液冷凍12 h后，于沸水浴、室溫和微波爐中解凍，反復3次，結果顯示沸水浴解凍破碎細胞提取的油脂產率最高，其油脂提取率為43.4%。杜曉鳳等[33]通過反復凍融法破碎細胞提取微綠球藻油脂，得到最大油脂提取率為23.86%。

4.8 微波輔助萃?。╩icrowave assisted extraction）

微波輔助萃取主要是利用微波輻射可以使細胞內的極性物質，如水吸收微波而使細胞內溫度迅速上升，液態(tài)水汽化時產生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小的孔洞，使細胞內的成分自由流動，從而再進行油脂提取[34]。微波輔助萃取具有提取時間短、耗能低、安全可靠、成本低和可同時處理多個樣品等多個優(yōu)良特性[35]，但是在微波過程中提取液溫度會增加，會導致某些脂肪酸成分損失。

LEE J Y等[36]利用高壓均質、陶瓷珠振蕩、超聲及滲透休克等方法從叢粒藻（Botryococcussp.），小球藻（Chlorella vulgaris）和柵藻（Scenedesmussp.）3種微藻中提取油脂，發(fā)現(xiàn)微波輔助對3種微藻的油脂提取率最高。BALASUBRAMANIAN S等[37]以正己烷作溶劑，利用連續(xù)微波萃取系統(tǒng)，其油脂提取率達76%～77%。

5 產業(yè)化前景及展望

超臨界CO2萃取法、有機溶劑萃取法、索氏抽提法、酸熱法、酶解輔助萃取、超聲波輔助萃取、反復凍融輔助萃取和微波輔助萃取均可適用于實驗室環(huán)境下微生物油脂的提取，但超臨界CO2萃取法需要專業(yè)設備，索氏抽提法提取時間較長，且處理量相對較少，工業(yè)生產成本較高，不適合工業(yè)生產。而反復凍融輔助萃取操作繁瑣，耗費時間，在工業(yè)生產過程中難以大規(guī)模應用。微波輔助萃取和超聲波輔助萃取在油脂提取過程中只要控制處理溫度，再輔以有機溶劑萃取，可以用于工業(yè)大規(guī)模油脂生產。在最適pH值和溫度的條件下，酶解輔助萃取操作簡單，得油率高，也可用于工業(yè)大規(guī)模生產油脂。

產油微生物的功能性油脂合成及代謝調控機制已經(jīng)逐漸清晰，油脂提取技術會逐漸向環(huán)保、安全和高效的方向發(fā)展。如利用現(xiàn)代生物學技術，對油脂微生物進行篩選，以提高其油脂產量和功能性脂肪酸的積累速度。同時，利用現(xiàn)代發(fā)酵技術，研究先進的發(fā)酵工藝，在降低成本的同時，提高產油微生物油脂產量，為油脂的工業(yè)化大規(guī)模應用提供基礎。

[1]RATLEDGE C.Lipid biotechnology a wonderland for the microbial physicologist[J].J Am Oil Chem Soc,1987,64(12):1647-1656.

[2]JANG H D,LIN Y Y,YANG S S.Effect of culture media and conditions on polyunsaturated fatty acids production byMortierella alpine[J].Bioresource Technol,2005,96(9):1633-1644.

[3]馬艷玲.微生物油脂及其生產工藝的研究進展[J].生物加工過程，2006，4（4）：7-1.

[4]DILLSCHNEIDER R,SCHULZE I,NEUMANN A,et al.Combination of algae and yeast fermentation for an integrated process to produce single cell oils[J].Appl Microbiol Biot,2014,98(18):7793-7802.

[5]何東平，陳 濤.微生物油脂學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2006.

[6]孫瑞貞.小米糠中亞油酸的提取及深加工利用[D].太原：山西大學碩士論文，2013.

[7]周同永，任 飛，鄧 黎，等.γ-亞麻酸及其生理生化功能研究進展[J].貴州農業(yè)科學，2011，39（3）：53-58.

[8]于新新.利用玉米黃漿水發(fā)酵生產花生四烯酸的研究[D].大慶：黑龍江八一農墾大學碩士論文，2013.

[9]王申強.裂殖壺菌產DHA 的發(fā)酵工藝研究及高產菌株選育[D].無錫：江南大學碩士論文，2013.

[10]周 林.微生物油脂研究概況[J].糧食與食品工業(yè)，2011，18（1）：20-23.

[11]趙春海.產油酵母的遺傳改良和油脂的發(fā)酵生產[D].青島：中國海洋大學博士論文，2011.

[12]孔祥莉.斯達氏油脂酵母2#利用葡萄糖和木糖混合發(fā)酵產油脂的研究[D].大連：遼寧師范大學碩士論文，2007.

[13]余增亮，王 紀，袁成凌，等.微生物油脂花生四烯酸產生菌離子束誘變和發(fā)酵調控[J].科學通報，2012，57（11）：883-890.

[14]薛照輝，吳謀成.微生物油脂進展[J].山西食品工業(yè)，2002（2）：10-11，26.

[15]魏 濤，王麗娟，張 飛，等.一株高產油脂酵母菌株的分離鑒定及其油脂組分的分析[J].中國釀造，2013，32（7）：55-57.

[16]董海艷.超臨界二氧化碳提取蕪菁子油及其成分分析[D].南京：南京農業(yè)大學碩士論文，2010.

[17]任 飛，韓 發(fā)，石麗娜，等.超臨界CO2萃取技術在植物油脂中的應用[J].中國油脂，2010，35（5）：14-16.

[18]王錦秀，郝小紅，田文杰，等.超臨界CO2萃取微藻油脂[EB/OL].北京：中國科技論文在線[2013-03-06].http：//www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201301-161.

[19]王莉娟，王衛(wèi)衛(wèi)，張 前，等.超臨界二氧化碳萃取絲狀真菌油脂及其成分測定[J].微生物學通報，2009，36（3）：383-388.

[20]蒿珍珍.皮狀絲孢酵母培養(yǎng)條件及油脂積累所需NADPH 來源的初步研究[D].上海：華東理工大學碩士論文，2013.

[21]孫曉璐，孫玉梅，曹 芳.對產油酵母的細胞破碎方法及油脂提取效果的比較[J].河南工業(yè)大學學報，2007，28（4）：67-69.

[22]GALAFASSI S,CUCCHETTI D,PIZZA F,et al.Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeastRhodotorula graminis[J].Bioresource Technol,2012,111(2):398-403.

[23]張鵬鵬.油脂高產菌株深黃被孢霉的誘變選育及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[D].洛陽：河南科技大學碩士論文，2013.

[24]ZHU M,ZHOU P P,YU L J.Extraction of lipids fromMortierella alpinaand enrichment of arachidonic acid from the fungal lipids[J].Bioresource Technol,2002,84(1):93-95.

[25]王 莉，宋兆齊，李江濤，等.不同提取工藝對產油酵母油脂產率的影響[J].中國油脂，2014，39（7）：13-16.

[26]耿青偉.幾種優(yōu)質產油真菌的篩選及發(fā)酵工藝研究[D].南京：南京林業(yè)大學碩士論文，2009.

[27]孫凡敏，趙祥穎，田延軍，等.酸熱法提取酵母油脂條件的研究[J].中國釀造，2010，29（5）：143-146.

[28]張秋紅.高EPA 含量眼點擬微綠球藻的培養(yǎng)與酶解提油工藝的研究[D].杭州：浙江工業(yè)大學碩士論文，2014.

[29]楊天喜.含糖廢水發(fā)酵產微生物油脂的分離提取工藝[D].北京：北京化工大學碩士論文，2013.

[30]劉圣臣，鄒 寧，吳電云，等.小球藻海藻油提取中不同破壁方法的研究[J].中國食品添加劑，2009，96（5）：100-102.

[31]王 敏，李市場，劉紅霞，等.黏紅酵母Rhodotorula glutinis微生物油脂提取工藝研究[J].中國糧油學報，2010，25（6）：71-75.

[32]馬千然.利用發(fā)酵廢母液培養(yǎng)小球藻及超聲波破壁提取油脂的工藝研究[D].北京：北京工商大學碩士論文，2013.

[33]杜曉鳳，鄒 寧，孫東紅.微綠球藻油脂提取方法的優(yōu)化[J].中國油脂，2012，37（5）：10-13.

[34]麻 林.微波提取原理及其設備的應用與設計[J].機電信息，2010，12（35）：42-45.

[35]席彩彩，張文芳，侯明月，等.微波提取技術在中藥有效成分提取中的應用[J].中國藥業(yè)，2010，23（3）：94-96.

[36]LEE J Y,YOO C,JUN S Y.et al.Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae[J].Bioresource Technol,2010,101(1):S75-S77.

[37]BALASUBRAMANIAN S,ALLEN J D,KANITKAR A,et al.Oil extraction fromScenedesmus obliquususing a continuous microwave system-design,optimization and quality characterization[J].Bioresource Technol,2011,102(3):3396-3403.