新疆喀什部分地區(qū)驢梨形蟲(chóng)病檢測(cè)初報(bào)

卡麗比努爾·爾肯，海尼木古麗·艾合買(mǎi)提，圖爾蓀·薩迪爾，沙塔爾·卡哈爾，巴音查汗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)托克遜縣夏鄉(xiāng)畜牧業(yè)服務(wù)中心，托克遜 838100；3.新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番市畜牧獸醫(yī)站，吐魯番838000 ）

·簡(jiǎn)報(bào)·

新疆喀什部分地區(qū)驢梨形蟲(chóng)病檢測(cè)初報(bào)

卡麗比努爾·爾肯1，海尼木古麗·艾合買(mǎi)提2，圖爾蓀·薩迪爾1，沙塔爾·卡哈爾3，巴音查汗1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)托克遜縣夏鄉(xiāng)畜牧業(yè)服務(wù)中心，托克遜 838100；3.新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番市畜牧獸醫(yī)站，吐魯番838000 ）

為了解新疆維吾爾自治區(qū)南疆部分地方驢泰勒蟲(chóng)和駑巴貝斯蟲(chóng)病的存在情況，本文采用PCR技術(shù)和競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（c-ELISA）檢測(cè)喀什部分地區(qū)驢泰勒蟲(chóng)病和駑巴貝斯蟲(chóng)病的流行情況。調(diào)查結(jié)果顯示，喀什地區(qū)疏勒縣和疏附縣驢寄生蟲(chóng)總感染率為45.17%。通過(guò)PCR方法檢測(cè)出19份血樣感染泰勒蟲(chóng)病，感染率為36.84%；未檢出駑巴貝斯蟲(chóng)病。通過(guò)c-ELISA方法檢測(cè)出96份血清感染泰勒蟲(chóng)病，感染率為7.29%；駑巴貝斯蟲(chóng)的感染率為1.04%。通過(guò)本次驢寄生蟲(chóng)感染調(diào)查，對(duì)喀什部分地區(qū)驢寄生蟲(chóng)感染情況有了初步了解，為該地區(qū)驢的健康發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)。

泰勒蟲(chóng)；駑巴貝斯蟲(chóng)；PCR；c-ELISA；檢測(cè)；驢

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2014年9月，在喀什市疏勒縣罕南力克鎮(zhèn)十村隨機(jī)抽取19頭驢，驢頸靜脈采集新鮮血樣于肝素抗凝管，-20℃保存，待檢。2014年10月，在喀什市疏附縣采集96頭驢血清，－20℃保存，待檢。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備泰勒蟲(chóng)抗體c-ELISA試劑盒（批號(hào)：P130726-001）、馬駑巴貝斯蟲(chóng)抗體c-ELISA試劑盒（批號(hào)：P140327-001）均購(gòu)自美國(guó)VMRD公司；ASCENT 型酶標(biāo)儀為芬蘭Thermo 公司產(chǎn)品；全血DNA提取試劑盒為T(mén)IANGEN公司產(chǎn)品。

1.3 驢全血基因組DNA的提取隨機(jī)采集喀什市疏勒縣罕尼力克鎮(zhèn)十村的19頭驢血樣，運(yùn)用全血DNA提取試劑盒提取血液的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)參考GenBank發(fā)表的駑巴貝斯蟲(chóng)BC48基因序列（登錄號(hào)：AB731213）和泰勒蟲(chóng)18S基因序列（登錄號(hào)：AB733376）[7]，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。BC48-F：5'-GGGCGACGTGACTAAGACCTTATT-3'，BC48-R1：5'-GTTCTCAATGTCAGTAGCATCCGC-3'；TE-F：5'-TTTgggCTgTTTACAgTTgC-3'，TE-R：5'-CTCAAAgTAAACgTCgAgTCATg-3'。

1.5 驢泰勒蟲(chóng)病和駑巴貝斯蟲(chóng)病的PCR診斷泰勒蟲(chóng)18S基因擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 2.5 μL、上下引物各1 μL、模板2 μL、2×dNTP Mix12.5 μL、補(bǔ)充滅菌ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。駑巴貝斯蟲(chóng)BC48基因擴(kuò)增體系：10×PCR buffer2.5 μL、上下引物各1 μL、模板2 μL、2×dNTP Mix12.5 μL、補(bǔ)充滅菌ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸4 min，10℃保存。

1.6 PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序按DNA純化膠回收試劑盒（Omega公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收，并與pEASY-T1載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)PCR鑒定陽(yáng)性克隆，送到上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 血清學(xué)檢測(cè)隨機(jī)采集了喀什市疏附縣96頭驢血清，采用c-ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，泰勒蟲(chóng)檢測(cè)試劑盒的批號(hào)為P130726-001，駑巴貝斯蟲(chóng)檢測(cè)試劑盒的批號(hào)為P140327-001。陰陽(yáng)值根據(jù)公式判斷：100-（100x/陰性O(shè)D平均值）≥40，小于x為陰性，大于x為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 驢泰勒蟲(chóng)病和駑巴貝斯蟲(chóng)病的PCR診斷結(jié)果喀什市疏勒縣19頭被檢驢血液根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明提取DNA，以其作為模板進(jìn)行驢泰勒蟲(chóng)和駑巴貝斯蟲(chóng)PCR。電泳結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2，泰勒蟲(chóng)條帶大小為539 bp，駑巴貝斯蟲(chóng)條帶大小為721 bp。

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測(cè)序，經(jīng)Blast分析鑒定為泰勒蟲(chóng)序列（圖略）。

IPCC第四次評(píng)估報(bào)告(IPCC,2007)指出,近百年來(lái)全球地表平均氣溫上升了0.74 ℃,與1980—1999年相比,未來(lái)20 a全球?qū)⒖赡茉鰷?.4 ℃,而到21世紀(jì)末將增溫1.1～6.4 ℃。IPCC第五次評(píng)估報(bào)告(IPCC,2013)認(rèn)為,氣候變化要比原來(lái)認(rèn)識(shí)的更加嚴(yán)重,而且有95%以上的把握認(rèn)為氣候變化是人類(lèi)的行為造成的。

2.3 驢泰勒蟲(chóng)病和駑巴貝斯蟲(chóng)病的EILSA檢測(cè)結(jié)果c-ELISA方法檢測(cè)了96份驢血清，測(cè)定其 OD450/ OD630值，所測(cè)泰勒蟲(chóng)樣品的陰性對(duì)照的平均值為

0.765，陽(yáng)性對(duì)照的平均值為0.274，血清判定臨界值為0.459，大于臨界值為陰性，小于臨界值為陽(yáng)性。檢測(cè)駑巴貝斯蟲(chóng)樣品的陰性性對(duì)照的平均值為0.888，陽(yáng)性對(duì)照的平均值為0.146，血清判定臨界值為0.533，大于臨界值為陰性，小于臨界值為陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 驢樣品的PCR檢測(cè)和EILSA檢測(cè)結(jié)果比較對(duì)喀什地區(qū)疏勒縣罕南力克鎮(zhèn)十村隨機(jī)抽取的19頭驢樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，泰勒蟲(chóng)病陽(yáng)性率為36.84%（7/19），未檢測(cè)出駑巴貝斯蟲(chóng)病。對(duì)PCR陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，鑒定為泰勒蟲(chóng)序列。再用c-ELISA方法對(duì)疏附縣96頭驢血清樣品檢測(cè)，泰勒蟲(chóng)的陽(yáng)性感染率為7.29%（7/96），駑巴貝斯蟲(chóng)的陽(yáng)性率為1.04%（1/96）。通過(guò)PCR和c-ELISA兩種方法結(jié)果顯示出，驢感染泰勒蟲(chóng)較嚴(yán)重，而駑巴貝斯蟲(chóng)的感染率較低甚至無(wú)感染，該地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)感染情況

有可能會(huì)影響當(dāng)?shù)伢H產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此應(yīng)引起有關(guān)部門(mén)的足夠重視。

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A PRELIMINARY SURVEY OF DONKEY PIROPLASMOSIS IN PART AREA
OF KASHGAR CITY

KALIBINUER·Erken1, HAINIMUGULI·Aihemaiti2, TUERSUN·Shadier1, SHATAER·Kahaer3, BAYINCHAHAN1
(1.College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2. Livestock Service Center of Tuokexun County, Xia Township, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Tuokexun County 838100, China; 3. Animal Husbandry and Veterinary Station of Turpan City, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Turpan 838000, China)

The prevalence of Babesia equi and Babesia caballi were examined in donkeys in Kashgar Prefecture, Xinjiang Uygur Autonomous Region using PCR and competitive enzyme-linked immunosorbent assay (c-ELISA). The overall parasite infection rate was 45.17% in donkeys from Shule County, Kashi city and Shufu County, Kashgar Prefecture. Total 19 blood samples were detected Babesia equi positive (36.84%) by PCR No Babesia caballi infection was detected. Total 96 serum samples were tested by c-ELISA and the positive rate was 7.29% for Babesia equi and 1.04% for Babesia caballi. The survey results provided preliminary information on parasitic infections in donkey population in southern Xinjiang.

Babesia equi; Babesia caballi; PCR; c-ELISA; detection; donkey

S852.723

B

1674-6422（2015）03-0065-04

2014-12-22

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD46801-4）

卡麗比努爾·爾肯 , 女，碩士研究生,預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)通信作者： 巴音查汗，E-mail:bynch@hotmail.com