鴨甲肝病毒與新型呼腸孤病毒復(fù)合RT-PCR檢測(cè)方法的建立

孫曉軍，王曉藝，韓宏宇，遲海華，楊宏禹，于可響

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2.山東省煙臺(tái)市姜格莊獸醫(yī)站，煙臺(tái)264100；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；4.山東省蓬萊市大柳行畜牧獸醫(yī)工作站，威海 265600）

·簡(jiǎn)報(bào)·

鴨甲肝病毒與新型呼腸孤病毒復(fù)合RT-PCR檢測(cè)方法的建立

孫曉軍1，王曉藝2，韓宏宇3，遲海華4，楊宏禹4，于可響1

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2.山東省煙臺(tái)市姜格莊獸醫(yī)站，煙臺(tái)264100；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；4.山東省蓬萊市大柳行畜牧獸醫(yī)工作站，威海 265600）

根據(jù)鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV）的3D基因序列和新型鴨呼腸孤病毒（Novel Duck reovirus, NDRV）的S3基因序列，分別設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，通過(guò)條件優(yōu)化建立了鑒別DHAV和NDRV的復(fù)合RT-PCR方法。該方法對(duì)DHAV和NDRV的最低檢出量均為100 copies，而對(duì)番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus, MDRV）、鴨瘟病毒（Duck plague virus, DPV）、鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）和鴨副粘病毒（Duck paramyxo virus, NDV）的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法是一種快速鑒別診斷DHAV和NDRV感染的有效手段。

鴨甲肝病毒；新型鴨呼腸孤病毒；復(fù)合RT-PCR；鑒別診斷

鴨病毒性肝炎（duck viral hepatitis，DHAV）又稱鴨肝炎，由鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus， DHAV）引起，5周齡以下的雛鴨對(duì)該病毒易感，其中1～3周齡內(nèi)的雛鴨最易感且死亡率高，部分可達(dá)

90%以上[1]。鴨病毒性肝炎波及面廣、發(fā)病率高、危害嚴(yán)重，是影響我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。DHAV分為A、B、C三個(gè)基因型，目前在我國(guó)流行的主要是A型和C型[2-4]。

新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）感染是近幾年發(fā)生的一種危害我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的新型疾病。該病毒可感染不同品種、不同日齡的鴨群，但以2周齡內(nèi)的雛鴨感染最常見，也最嚴(yán)重，死亡率為5%～20%[5,6]。新型鴨呼腸孤病毒與禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）以及傳統(tǒng)的番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）在基因序列、生物學(xué)特性、抗原相關(guān)性方面均存在較大差

異[7,8]。

DHAV和新型NDRV都以侵害雛鴨為主，在臨床上容易發(fā)生混合感染。本研究利用PCR技術(shù)快速、準(zhǔn)確、敏感性高的特點(diǎn)，建立了鑒別DHAV和新型NDRV這兩種病毒的復(fù)合RT-PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與SPF雞胚新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）、A型鴨甲肝病毒（DHAV-A）、C型鴨甲肝病毒（DHAV-C）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、鴨瘟病毒（Duck plague virus, DPV）、鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）和鴨副粘病毒（Duck paramyxo virus, DPMV）均由山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、保存；SPF鴨胚由山東省農(nóng)科院家禽研究所昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）購(gòu)自TaKaRa（大連）公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α由山東省禽病免疫與診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中發(fā)表的DHAV的3D基 因 序 列（ 登 錄 號(hào)：DQ864514/ Q122332）， 利 用Primer premier 5.0軟 件 設(shè) 計(jì)了1對(duì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增片段大小為304 bp，DHAV1：5'-CTTTCYATCAATGACCARCG-3'，DHAV2：5'-GHADTTGMTCCATAACATCCTG-3'（R＝A或者G；M＝A或者C；Y＝C或者T；H＝A、T或 者C；D=G、A或 者T）； 根據(jù)GenBank中發(fā)表的NDRV的S3基因序列（登錄 號(hào)：KJ879932）， 利 用 Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，擴(kuò)增片段大小為148 bp，NDRV1：5'-GTAAGCAACCTCAGGATATCG-3' ，NDRV2：5'-TCATGTCGCGCGTCGTAT-3'。

1.4 病毒增殖將DHAV-A、DHAV-C和NDRV分別接種10日齡SPF鴨胚，37℃恒溫培養(yǎng)，收獲接種24 h后死亡鴨胚的尿囊液，提取病毒RNA。

1.5 陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建按照RNAiso Reagent試劑說(shuō)明提取DHAV-A、DHAV-C和NDRV的RNA，加入適量無(wú)RNA酶的去離子水溶解。分別以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以各自的特異性引物為擴(kuò)增引物，按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。按照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5α。挑菌提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR和酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的菌落送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并與GenBank中的參考序列進(jìn)行比較。DHAV-A、DHAV-C和NDRV的陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pMD-A、pMD-C和pMD-R。

1.6 復(fù)合RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化按照TRIzol試劑說(shuō)明提取病毒RNA，加入適量的DEPC處理水溶解。參考M-MLV說(shuō)明書，從引物濃度、退火溫度以及反應(yīng)體系方面進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化。

1.7 敏感性試驗(yàn)分別提取陽(yáng)性質(zhì)粒pMD-A、pMD-C和pMD-R，利用分光光度計(jì)測(cè)定含量，將3種質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，濃度為1×100～1×105copies/μL（即PCR反應(yīng)體系中質(zhì)粒含量分別為1×100～1×105copies），利用常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，各取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以確定該方法對(duì)這3種陽(yáng)性質(zhì)粒的最小檢出量。

1.8 特異性試驗(yàn)分別提取DHAV-A、DHAV-C、NDRV、MDRV、PV、DTMUV、DPMV以及NDRV與DHAV混合物的RNA，并以此為模板利用上述優(yōu)化的反應(yīng)條件分別進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)利用該復(fù)合RT-PCR方法分別對(duì)A

型DHAV陽(yáng)性病料和NDRV陽(yáng)性病料進(jìn)行擴(kuò)增，各重復(fù)3次，確定其重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測(cè)從不同鴨場(chǎng)收集疑似病變組織50份，應(yīng)用本研究建立的復(fù)合RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將樣品處理后經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF鴨胚進(jìn)行分離，盲傳3代后，通過(guò)中和試驗(yàn)對(duì)分離物進(jìn)行鑒定，比較兩種方法的符合性。

2 結(jié)果與討論

2.1 敏感性試驗(yàn)提取陽(yáng)性質(zhì)粒pMD-A、pMD-C和pMD-R，測(cè)定含量后分別做10倍梯度稀釋，利用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，該檢測(cè)方法對(duì)這3種陽(yáng)性質(zhì)粒的最低檢出量均為100 copies（圖1）。

2.2 復(fù)合RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化通過(guò)對(duì)引物濃度、退火溫度以及反應(yīng)體系等反應(yīng)條件的反復(fù)優(yōu)化，最終確定的反應(yīng)條件為：在PCR管中加入RNA 5 μL，10 μmol/L dNTP 2 μL，10 pmol/μL引物DHAV1、DHAV2各2 μL，10 pmol/μL引物NDRV1、NDRV2各0.5 μL，經(jīng)70℃加熱5 min后，冰浴放置2 min ，然后依次加入下列成分：5×RT buffer 4 μL、40U/μL Rnasin 0.5 μL、200U/μL M-MLV 1 μL、DEPC處理水2.5 μL，反應(yīng)總體積20 μL，輕輕混勻，42℃ 30 min，95℃ 2 min。然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL、10×PCR buffer 5 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、滅菌ddH2O 43.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

2.3 特異性試驗(yàn)利用建立的復(fù)合RT-PCR方法對(duì)包括DHAV和NDRV在內(nèi)的幾種常見的鴨病毒病進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該方法能從A型和C型DHAV中擴(kuò)增到304 bp的目的條帶，從NDRV中擴(kuò)增到148 bp的目的條帶，從NDRV與DHAV混合物中擴(kuò)增到304 bp和148 bp兩條目的條帶，而對(duì)MDRV、DPV、DTMUV、DPMV擴(kuò)增不出任何條帶（圖2）。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)利用復(fù)合RT-PCR方法分別對(duì)DHAV-A和NDRV陽(yáng)性的病料進(jìn)行擴(kuò)增，各重復(fù)3次，結(jié)果顯示，3次重復(fù)均能擴(kuò)增出目的條帶，且條帶的亮度基本一致（圖3）。

2.5 臨床樣品檢測(cè)利用復(fù)合RT-PCR方法對(duì)50份樣

品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出DHAV陽(yáng)性病料27份，陽(yáng)性檢出率為54%，而病毒分離鑒定檢出陽(yáng)性病料25份，陽(yáng)性檢出率為50%，兩種方法的符合率為96%（表1）。檢出NDRV陽(yáng)性病料7份，陽(yáng)性檢出率為14%，而病毒分離鑒定檢出陽(yáng)性病料4份，陽(yáng)性檢出率為8%，兩種方法的符合率為94%（表2）。

2.6鴨病毒性肝炎和新型鴨呼腸孤病毒感染是臨床上

常見的鴨病，它們都以侵害雛鴨為主，治療均以抗體注射為主，因此只有將兩者區(qū)分開，給予相應(yīng)的抗體，才能取得很好的療效。傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高，并且很難區(qū)分兩者的混合感染，因此需要建立更快速、更有效的檢測(cè)方法。復(fù)合PCR是一種特殊的PCR形式，既具有常規(guī)PCR準(zhǔn)確、快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)，又可同時(shí)鑒別多種病原，滿足臨床上同時(shí)對(duì)多種疾病進(jìn)行診斷的要求[9,10]。

本研究根據(jù)DHAV和NDRV基因的保守序列分別設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，建立了用來(lái)鑒別這兩

種病毒的復(fù)合RT-PCR方法。通過(guò)敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)DHAV-A、DHAV-C和NDRV的最低檢出量均為100 copies，說(shuō)明該方法敏感度較高。復(fù)合RT-PCR特異性試驗(yàn)表明，對(duì)DHAV-A、DHAV-C和NDRV的擴(kuò)增條帶均為單一條帶，而對(duì)MDRV、DPV、DTMUV和DPMV擴(kuò)增不出條帶，說(shuō)明該方法具有良好的特異性。

復(fù)合PCR具有短片段優(yōu)先擴(kuò)增的特點(diǎn)，即當(dāng)反應(yīng)體系中同時(shí)含有兩對(duì)或兩對(duì)以上的引物和模板時(shí)，反應(yīng)總是有利于片段較小的一方[11]。根據(jù)這一原理，為了在檢測(cè)混合感染時(shí)獲得較好的擴(kuò)增效果，筆者對(duì)引物濃度、退火溫度以及反應(yīng)體系進(jìn)行了反復(fù)優(yōu)化，最終獲得了DHAV與NDRV復(fù)合RT-PCR檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)條件。

本研究建立的復(fù)合RT-PCR方法具有敏感、特異、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需4～5 h，可作為一種快速鑒別DHAV與NDRV混合感染的有效手段。

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MULTIPLEX RT-PCR FOR DETECTION OF DUCK HEPATITIS A VIRUS AND NOVEL DUCK REOVIRUS

SUN Xiao-jun1, WANG Xiao-yi2, HAN Hong-yu3, CHI Hai-hua4, YANG Hong-yu4, YU Ke-xiang1
(1. Key Laboratory of Poultry Disease Diagnosis and Immunology of Shandong Province, Institute of Poultry, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250023, China; 2. Jianggezhuang Veterinary Station of Yantai City, Shandong Province, Yantai 264100, China; 3. College of Animal Science Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China 4. Daliuhang Veterinary Station of Penglai City, Shandong Province, Weihai 265600, China)

A multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for detecting Duck hepatitis A virus (DHAV) and Novel duck reovirus (NDRV) was developed using two primers based on 3D gene of DHAV and S3 gene of NDRV. The detection limit of the RT-PCR assay was 100 copies for both viruses. Mean while, the method had no reaction with Muscovy duck reovirus (MDRV), Duck plague virus (DPV), Duck Tembusu virus (DTMUV) and Duck paramyxo virus (NDV). The results of testing clinical samples showed the assay was a useful technique for differential detection of DHAV and NDRV.

Duck hepatitis A virus; Novel duck reovirus; multiplex reverse transcription polymerase chain reaction; differential diagnosis

S852.659.6

B

1674-6422（2015）03-0050-05

2014-12-31

山東省海外高層次人才（泰山學(xué)者）引進(jìn)計(jì)劃；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（SDAIT-13-011 -01）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003012）

孫曉軍，男，碩士，主要從事家禽疫病的防控研究

于可響，E-mail：yukx1979@163.com；楊宏禹，E-mail：429791224@qq.com