鴨Toll樣受體3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

宋凱杰，陳宗艷，黃云秀,3，李傳峰，孟春春，李丹丹，張淼濤，劉光清

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；3.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530005）

·研究論文·

鴨Toll樣受體3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

宋凱杰1,2，陳宗艷1，黃云秀1,3，李傳峰1，孟春春1，李丹丹1,2，張淼濤2，劉光清1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；3.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530005）

根據(jù)鴨Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）的基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，以鴨β肌動(dòng)蛋白(β-actin) mRNA為內(nèi)參，建立了一種檢測(cè)鴨TLR3 mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線在1×102～1×108copies/μL范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)和擴(kuò)增效率均在0.9以上。熔解曲線顯示，PCR產(chǎn)物為單峰，具有高度擴(kuò)增特異性。重復(fù)性結(jié)果表明，該方法組內(nèi)、組間變異系數(shù)均小于3 %，最低檢測(cè)濃度達(dá)100 copies/μL。利用該方法檢測(cè)了TLR3在鴨組織器官中的表達(dá)和分布情況，結(jié)果表明，TLR3在鴨子的各種組織或器官中均有分布，其中以氣管的表達(dá)水平最高，而在脾臟的表達(dá)水平最低。該檢測(cè)方法的成功建立為研究TLR3在鴨天然免疫過(guò)程中的生物學(xué)功能提供了良好的技術(shù)手段。

TLR3；熒光定量PCR；北京鴨

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）在檢測(cè)病原體相關(guān)模式分子時(shí)扮演重要角色。病原體相關(guān)模式分子是病原體保守的部分結(jié)構(gòu)分子，對(duì)于病原體的生存是必要的，因此成為先天性免疫系統(tǒng)檢測(cè)的理想目標(biāo)。目前為止，從哺乳動(dòng)物中已經(jīng)鑒定出13種TLR3[1]，其中TLR1～9是人和鼠都具有的，TLR10只在人類中有功能，TLR11-13只存在于鼠中[2-4]。許多TLR但并不是所有的TLR被用來(lái)應(yīng)答特異性的病原體相關(guān)模式分子，通過(guò)研究TLR缺陷型小鼠可確定其具體功能。相對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，禽類TLR研究進(jìn)展緩慢。為全面了解TLR的結(jié)構(gòu)和功能以及TLR種屬差異導(dǎo)致的不同功能，對(duì)禽TLR進(jìn)行深入研究很有必要。

目前，在鴨種屬已發(fā)現(xiàn)TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR7。雞TLR與哺乳動(dòng)物存在一些差異[5-8]。TLR屬于I型跨膜蛋白，含有N末端的配體識(shí)別區(qū)域、跨膜螺旋區(qū)和C末端的胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)[9]。TLR3位于內(nèi)體膜上，識(shí)別病毒產(chǎn)生的雙鏈RNA后，激活轉(zhuǎn)錄因子NFkB、IRF3/7/5或者AP1，這些細(xì)胞因子合力促使細(xì)胞生成大量細(xì)胞因子和干擾素，從而抵抗病毒的感染和侵害[10]。由此看來(lái)，TLR在病毒防御起始階段發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。近幾年，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物TLR mRNA水平的檢測(cè)[11,12]，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)應(yīng)用此技術(shù)研究鴨TLR的報(bào)道。本研究建立了鴨TLR3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，同時(shí)分析了鴨TLR3在各組織的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，為研究鴨TLR3在鴨發(fā)病過(guò)程中作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株及主要試劑大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-T5-zero載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；GoTaq? qPCR Master Mix、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購(gòu)自Promega公司；熒光定量PCR反應(yīng)管購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)運(yùn)用Primer premier 3.0和Primer premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)了本研究中的各種引物（表1）。TLR3全長(zhǎng)基因擴(kuò)增產(chǎn)物引物為TLR3-F和TLR3-R，預(yù)期產(chǎn)物大小為2701 bp，熒光定量PCR檢測(cè)引物為qTLR3-F和qTLR3-R，產(chǎn)物大小為239 bp；鴨β-actin為內(nèi)參基因，引物為qβ-actin-F/R，預(yù)期產(chǎn)物大小為199 bp。

1.3 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

1.3.1 總RNA的提取和cDNA合成 從北京鴨（Anas platyrhynchos）的血液中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），Trizol法抽提總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為：RNA 1 μg、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 1 μL、

5×Reaction Buffer 5 μL、核酶抑制劑RRI 1 μL、dNTP mix (10 mmol/L) 1 μL、隨機(jī)引物 2 μL，補(bǔ)足無(wú)RNase水至25 μL體系。渦旋混合后37℃水浴條件下反應(yīng)1 h，85℃、15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)物于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以cDNA為模板使用

TLR3-F/R和qβ-actin-F/R分別擴(kuò)增TLR3基因和β-actin內(nèi)參基因。反應(yīng)體系：2×Premix Ex Taq 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL。TLR3的PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 再延伸10 min。β-actin的PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃變性30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min?；厥誔CR產(chǎn)物并分別克隆至pEASY-T5-Zero載體中，轉(zhuǎn)化trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，挑斑鑒定重組質(zhì)粒陽(yáng)性菌后，即得pEASY-T5-TLR3重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒送測(cè)序公司，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。質(zhì)粒于-20℃保存。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)方法的建立

1.4.1 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 以重組質(zhì)粒為模板，采用矩陣法篩選引物的最佳濃度，并對(duì)循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系為20 μL，其中GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL，TLR3定量PCR引 物 qTLR3-F、qTLR3-R各 1 μL，β-actin定量引物與擴(kuò)增引物相同均為qβ-actin-F、qβactin-R，終濃度各為0.5 μmol/L，重組質(zhì)粒模板（含1000 copies）2 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL。優(yōu)化反應(yīng)條件采用兩步法PCR：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線條件：95℃ 15 s，60℃ 15 s；梯度遞增升溫至95℃ 20 min，95℃ 15 s。同時(shí)設(shè)立無(wú)模板的空白對(duì)照（NTC）。1.4.2 TLR3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將TLR3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于pEASY-T5-Zero載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEASY-T5-TLR3。以重組質(zhì)粒pEASYT5-TLR3為標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的OD260值，根據(jù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的分子量與質(zhì)量濃度，計(jì)算其拷貝濃度。調(diào)整濃度后10倍稀釋至1.0×102～1.0×108copies/μL，作為模板，進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增，以重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，循環(huán)次數(shù)（Ct）為Y軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 重復(fù)性驗(yàn)證 對(duì)1.0×103～108copies/μL的質(zhì)粒DNA進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，同一時(shí)期進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)；不同時(shí)期對(duì)上述質(zhì)粒進(jìn)行批間重復(fù)。

1.4.4 敏感性驗(yàn)證 以拷貝濃度為1.0×101～1.0×105copies/μL的pEASY-Blunt-duTLR3重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照（NTC）。1.4.5 特異性驗(yàn)證 為了分析RT-PCR擴(kuò)增的特異性，用優(yōu)化的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并分析溶解曲線；定量PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)核酸電泳后，切膠回收目的片段，測(cè)序分析其擴(kuò)增基因片段特異性。

1.5 TLR3在北京鴨體內(nèi)的組織表達(dá)譜采取2周齡健康北京鴨的肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟、食道、氣管、腺胃、肌胃、胰腺、十二指腸、空腸、盲腸、法氏囊、胸腺、哈氏腺、腦組、皮膚、肌肉以及骨髓等臟器，稱量各組織0.5 g，液氮條件下研磨，Trizol法提取組織總RNA。酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：RNA (1 μg)、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 1 μL、5×Reaction Buffer 5 μL、核酶抑制劑RRI 1 μL、dNTP mix (10 mmol/L) 1 μL、隨機(jī)引物 2 μL，補(bǔ)足無(wú)RNase水至25 μL體系。渦旋混合后37℃水浴條件下反應(yīng)1 h，85℃、15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)物于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板，采用建立的方法進(jìn)行TLR3的定量，定量PCR體系：GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL，TLR3定量PCR引物qTLR3-F、qTLR3-R各1 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL，同時(shí)做內(nèi)參β-actin對(duì)照。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法處理，對(duì)每個(gè)組織設(shè)立3個(gè)重復(fù)，首先計(jì)算各組織的目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值，即ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），然后計(jì)算各基因的ΔCt平均值，選取脾臟TLR3基因作為對(duì)照，用其他基因的ΔCt減去脾臟基因的ΔCt，即為ΔΔCt；2-ΔΔCt表示各組織TLR3基因的表達(dá)相對(duì)于脾臟基因的變化倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 TLR3和β-actin 基因的擴(kuò)增對(duì)TLR3全長(zhǎng)和β-actin的部分基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示獲得的條帶與預(yù)期結(jié)果相似（圖略）。其中TLR3擴(kuò)增大小為2701 bp，β-actin大小為199 bp。膠回收后連接至pEASY-T5-Zero載體、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，挑斑鑒定目的片段。測(cè)序結(jié)果使用在線BLASTn軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與參考序列的核苷酸完全一致。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立結(jié)果

2.2.1 TLR3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以1.0×102～1.0×108copies/μL重組質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)為X軸，循環(huán)次數(shù)（Ct）為Y軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，TLR3標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度擴(kuò)增曲線良好（見(jiàn)圖1A和圖2A），Ct值相差均勻反映不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品Ct值與拷貝數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，擴(kuò)增效率達(dá)90%，起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與Ct值線性關(guān)系為Y=-3.599X+37.01。

2.2.2 β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以1.0×102～1.0×107copies/μL重組質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)為X軸，循環(huán)次數(shù)（Ct）為Y軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線良好（見(jiàn)圖1B和圖2B），Ct值相差均勻反映不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品Ct值與拷貝數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，擴(kuò)增效率達(dá)92%，起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與Ct值線性關(guān)系為Y=-3.531X+38.05。

2.3 qRT-PCR重復(fù)性驗(yàn)證對(duì)1.0×103～108copies/ μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA重復(fù)擴(kuò)增，檢測(cè)PCR的精確度。結(jié)果表明，Ct值變異系數(shù)均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好（表2）。

2.4 qRT-PCR特異性驗(yàn)證定量PCR熔解曲線顯示，溶解峰集中一致，無(wú)雜峰和小峰出現(xiàn)，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增；測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，確定為TLR3基因和β-actin內(nèi)參基因，進(jìn)一步證實(shí)PCR擴(kuò)增的特異性。熔解曲線顯示，TLR3基因各濃度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品均在83℃出現(xiàn)特異性熔解峰（圖3A），β-actin內(nèi)參基因各濃度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品均在86℃出現(xiàn)特異性熔解峰（圖3B）。

2.5 qRT-PCR敏感性驗(yàn)證取不同拷貝濃度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)特異性熒光擴(kuò)增，陰性對(duì)照無(wú)熒光擴(kuò)增，TLR3和β-actin最低檢測(cè)拷貝濃度100 copies/μL，表明本試驗(yàn)建立的qRT-PCR方法靈敏度為1.0×102copies/ μL（見(jiàn)圖2）。

2.6 TLR3在北京鴨體內(nèi)的組織表達(dá)譜通過(guò)對(duì)樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TLR3基因廣泛分布于北京鴨的各組織器官，在氣管、食道、胰腺中表達(dá)量較高，在脾臟、骨髓、盲腸、肌胃和法氏囊表達(dá)水平較低(圖4)。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種新型檢測(cè)技術(shù)。它是在普通PCR反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，加入熒光染料或熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進(jìn)行，對(duì)反應(yīng)體系的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定未知樣品的含量。傳統(tǒng)的PCR定量是應(yīng)用終點(diǎn)PCR來(lái)對(duì)樣品中的模板量進(jìn)行定量，通常用凝膠電泳分離，并用熒光染色來(lái)檢測(cè)PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物。由于模板、試劑、焦磷酸鹽分子的聚集等因素影響聚合酶反應(yīng)，最終導(dǎo)致PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式進(jìn)行而進(jìn)入“平臺(tái)期”，而且一些反應(yīng)的終產(chǎn)物比另一些要多，因此終點(diǎn)PCR反應(yīng)方法定量并不準(zhǔn)確。相比普通PCR，定量PCR省去了核酸電泳的步驟，比普通PCR的半定量分析更準(zhǔn)確，并且不易污染從而避免出現(xiàn)假陽(yáng)性。常用的定量PCR有探針?lè)ê蜔晒馊玖戏āＬ结樂(lè)ǖ奶结樤O(shè)計(jì)、合成、標(biāo)記以及純化等都相對(duì)比較困難，而且價(jià)格成本較高，往往需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針來(lái)篩選，從而無(wú)形中增加了難度。染料法特異性雖不如探針?lè)ǜ撸O(shè)計(jì)較為容易，成本低，而且也可以從熔解曲線來(lái)判斷其特異性。定量PCR包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量主要用于檢測(cè)病原體的含量，在缺少內(nèi)參基因的情況下，用已知模板量做外參照來(lái)定量以及用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性和突變分析。相對(duì)定量主要用于一些基因表達(dá)研究。

GoTaq? qPCR Master Mix 是用于實(shí)時(shí)定量 PCR (qPCR 和 RT-qPCR) 的新型試劑系統(tǒng)。該試劑系統(tǒng)包含一種新的 DNA 結(jié)合熒光染料（BRYT 綠色染料），與雙鏈 DNA 結(jié)合后，能夠產(chǎn)生強(qiáng)度高于 SYBR?Green I 的熒光，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的BRYT 綠色染料的熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。由于標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式的斜度可以用來(lái)檢查 PCR 的效率，所有線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù) (R2＞0.99) ，這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和數(shù)據(jù)是可信的, 從而使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量[13]。本研究建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上，擴(kuò)增效率在90%以上，符合2-ΔΔCt方法要求，可以用于鴨TLR3的定量分析；熔解曲線分析表明，此方法擴(kuò)增的TLR3和β-actin只出現(xiàn)一個(gè)特異性單峰，無(wú)引物二聚體或其他非特異性產(chǎn)物；對(duì)各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)表明，TLR3和β-actin敏感度達(dá)100 copies/μL，可對(duì)組織中目的基因的表達(dá)進(jìn)行直接檢測(cè)；重復(fù)性和穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好。

對(duì)北京鴨TLR3在20種組織分布發(fā)現(xiàn)，在氣管、

食道、胰腺呈高水平表達(dá)，這與Jiao等[14]對(duì)番鴨的TLR3組織分布的研究結(jié)果相一致，在肝臟、心臟、腎臟、腺胃、十二指腸、空腸、皮膚和肌肉呈中度水平表達(dá)，在脾臟、肺臟、肌胃、盲腸、法氏囊、胸腺、哈氏腺和骨髓呈低水平表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，鴨TLR3廣泛分布于各個(gè)組織，而在與免疫相關(guān)組織中并不是高水平表達(dá)，這可能由于機(jī)體處于健康狀態(tài)，在沒(méi)有病原體的感染的情況下，免疫組織的TLR3處于沉默狀態(tài)，一旦機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)感受到了病原體的入侵，會(huì)迅速產(chǎn)生應(yīng)答。鴨TLR3的廣泛分布從側(cè)面也反映了機(jī)體可以全方位及時(shí)感受外源刺激，從而通過(guò)機(jī)體的各器官協(xié)作，發(fā)出危險(xiǎn)信號(hào)，誘發(fā)機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)及時(shí)作出應(yīng)答反應(yīng)[15,16]。Qi等[17]運(yùn)用半定量的方法檢測(cè)鵝TLR7的組織分布，用β-actin作為對(duì)照發(fā)現(xiàn)法氏囊的表達(dá)量最高。Zhao等[18]運(yùn)用熒光定量PCR方法研究正常金定鴨的TLR4組織分布，發(fā)現(xiàn)在脾臟呈高水平表達(dá)，在胸腺、肺臟、肝臟、腎臟也有表達(dá)。Xiong等[19]運(yùn)用半定量PCR分析了正常翹鼻麻鴨TLR5的組織分布，發(fā)現(xiàn)在肺臟、骨髓、脾臟和肝臟高水平表達(dá)，在腎臟、小腸、大腸和腦中度表達(dá)，在心臟、頸部淋巴結(jié)、盲腸和外周血單核細(xì)胞低水平表達(dá)。Megan等[20]運(yùn)用半定量PCR分析了健康北京鴨TLR7的組織分布，發(fā)現(xiàn)在法氏囊、肺臟和脾臟高水平表達(dá)，在十二指腸、腎臟和肝臟呈低水平表達(dá)，在心和腦呈微量表達(dá)。確定TLR在不同組織的本底表達(dá)譜和表達(dá)水平不僅僅能夠提示天然的病原體相關(guān)模式分子在各種組織的載量，也可以暗示組織抵抗病原體的能力[16]。

本研究成功建立了鴨TLR3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，并繪制了TLR3組織分布譜。該技術(shù)為鴨TLR3后續(xù)的功能研究提供了便利，對(duì)于揭示鴨TLR3的抗病毒機(jī)制具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

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DEVELOPMENT OF REAL-TIME FLUORESCENCE QUANTITATIVE PCR ASSAY FOR DETECTION OF DUCK TOLL-LIKE RECEPTOR 3

SONG Kai-jie1,2, CHEN Zong-yan1, HUANG Yun-xiu1,3, LI Chuan-feng1, MENG Chun-chun1, LI Dan-dan1,2, ZHANG Miao-tao2, LIU Guang-qing1
(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 3. College of Animal Sciences and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)

The objective of the present study was to develop a real-time f uorescence quantitative PCR (qRT-PCR) assay for detection of duck Toll-like receptor 3(TLR3) mRNA. A pair of specif c primers were designed according to the gene sequences of duck TLR3 available in GenBank. The β-actin mRNA was used as internal control. The standard curves of this method showed good linear relationships (R2＞0.99) and eff ciency about 0.9 in the range of 1×102to 1×108copies/μL. The qRT-PCR assay was specif c for detecting TLR3 mRNA as analyzed for melting curves. In addition, the minimum detectable concentrations of positive plasmids of TLR3 and β-actin were 100 copies/μL. Both intra-assay and inter-assay coeff cients of variation were less than 3%. To verify whether this method was valid, the tissue distribution of TLR3 was examined using the qRT-PCR assay. The results showed that TLR3 was widely expressed in various tissues of duck with the highest expression level in trachea and lowest expression level in spleen.

Toll-like receptor 3; real-time RT-PCR; Peking duck

S852.42

A

1674-6422（2015）03-0042-08

2015-05-04

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303046)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270194；31101848)；上海市科委創(chuàng)新項(xiàng)目(13391901602)

宋凱杰，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

劉光清，E-mail：liugq@shvri.ac.cn；張淼濤，E-mail：zmt6371@yahoo.com.cn