磺胺氯吡嗪鈉單克隆抗體的制備及鑒定

張 夢，劉迎春，蔣 蔚，陳永軍，張花景，薛俊欣,2，宮楓舉,2，曾 鵬,2，王民燕，王 權(quán)

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095）

·研究論文·

磺胺氯吡嗪鈉單克隆抗體的制備及鑒定

張 夢1，劉迎春1，蔣 蔚1，陳永軍1，張花景1，薛俊欣1,2，宮楓舉1,2，曾 鵬1,2，王民燕1，王 權(quán)1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095）

應(yīng)用重氮化方法制備了磺胺氯吡嗪鈉（sulfachloropyrazine sodium, SPZ）完全抗原SPZ-OVA，將成功偶聯(lián)的人工全抗原（SPZ-OVA）免疫BALB/c小鼠，免疫4次后，經(jīng)間接ELISA檢測，1號小鼠血清抗體效價達到1 : 6.4×104。取該小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合。利用ELISA方法對融合后的雜交瘤細胞上清進行檢測，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗體的細胞株：D9。將細胞株D9擴大培養(yǎng)后，經(jīng)腹腔注射小鼠使其產(chǎn)生腹水。腹水單抗經(jīng)純化后，通過間接競爭ELISA對該單克隆抗體的效價、半數(shù)抑制濃度以及特異性進行檢測。結(jié)果表明，所制備的單克隆抗體效價為1 : 4×105，半數(shù)抑制濃度為326 ng/mL，特異性良好。

磺胺氯吡嗪鈉；單克隆抗體；間接競爭ELISA

磺胺類藥物（sulfonamides，SAs）具有對氨基苯磺酸結(jié)構(gòu)，該類藥物抗菌譜廣，因其價格低廉、使用方便在動物養(yǎng)殖中被廣泛使用[1]。其中磺胺氯吡嗪鈉 (sulfachloropyrazine sodium，SPZ) 具有在動物體內(nèi)作用持續(xù)時間長，且不影響宿主對球蟲的免疫力等特點，從而被用于治療家禽球蟲病[2]。有研究表明SPZ也可抑制弓形蟲速殖子的繁殖[3]。然而磺胺類藥物作為飼料添加劑，卻往往導致多種細菌產(chǎn)生抗藥性，威脅人類健康[4]。為此，亞洲和歐美等多個國家規(guī)定了動物性食品中磺胺類藥物的最高殘留限量（maximum residue limit, MRL）為0.1 mg/ kg[5]，我國規(guī)定動物源性食品中磺胺類藥物的MRL為0.05～0.1 mg/kg[6]。

目前，磺胺類藥物殘留檢測常采用氣相色譜法[7,8]、液相色譜法[9,10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等。與理化檢測方法相比，免疫學方法具有特異性強、操作簡單、靈敏度高的特點，因此，本研究擬制備磺胺氯吡嗪鈉的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立間接競爭ELISA（indirect copetitive ELISA，ci-ELISA）方法，為該藥殘留檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑BALB/c小鼠，昆明系小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司；磺胺氯吡嗪鈉（含量99.97%，批號：091001）、磺胺嘧啶鈉（含量99.53%，批號：091001）、磺胺對甲氧基嘧啶鈉（含量99.23%，批號：090803）、磺胺氯噠嗪鈉（含量99.81%，批號：20091101）、磺胺甲氧噠嗪鈉（含量99.50%，批號：20091101）和磺胺二甲嘧啶鈉（含量99.55%，批號：090911）購于上海寶山振宗生物工程廠；40%PEG、牛血清蛋白（BSA）和卵白蛋白(OVA) 購于美國Sigma公司；NaNO2和鹽酸購于國藥集團上?；瘜W試劑公司；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為本實驗室保存。

1.2 磺胺氯吡嗪鈉（SPZ）免疫原的制備及鑒定

1.2.1 磺胺氯吡嗪鈉（SPZ）完全抗原SPZ-OVA及包被原SPZ-BSA的制備 通過重氮化方法制備其免疫原及包被原。首先對SPZ進行重氮化反應(yīng)：稱取SPZ 10 mg，用少量蒸餾水溶解，在4℃條件下同時緩慢滴加預冷的鹽酸（0.1 mol/L）和NaNO2水溶液（10 g/L），并用淀粉碘化鉀試紙實時監(jiān)測，試紙剛變藍時停止滴加反應(yīng)液，4℃避光反應(yīng)10 min。

取25 mg的OVA溶于1 mL的碳酸鹽緩沖溶液（pH 9.6，0.2 mol/L）中，離心后取上清，在4℃條件下，逐滴加入NaOH（1 mol/L）和重氮化的SPZ溶液，并持續(xù)攪拌，保證反應(yīng)體系的pH值在10左右。4℃避光反應(yīng)過夜，然后用PBS（pH 7.4）透析，每天更換透析液3次，透析3 d。將制備的SPZ-OVA分裝、標記，-20℃保存。

包被抗原（SPZ-BSA）的制備，用BSA替代OVA，其他操作同上。

1.2.2 完全抗原鑒定 把透析好的免疫原SPZ-OVA和載體蛋白OVA用PBS配制成200 ng/mL溶液，將藥物SPZ用PBS配制成50 μg/mL溶液，用紫外分光光度計分別進行紫外掃描，通過比較藥物和偶聯(lián)物的紫外圖譜對偶聯(lián)結(jié)果進行驗證。

1.3 單克隆抗體制備

1.3.1 小鼠免疫 取8周齡BALB/c小鼠2只，將SPZ-OVA用弗氏完全佐劑乳化后，足墊注射小鼠進行首次免疫，劑量為200 μg/只。隨后每2周對小鼠加強免疫1次，用與首次免疫等劑量抗原和弗氏不完全佐劑乳化后，皮下多點注射免疫。細胞融合前3 d，小鼠腹腔直接注射SPZ-OVA，250 μg/只，進行1次加強免疫。

1.3.2 細胞融合及培養(yǎng) 細胞融合時取對數(shù)生長期小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）和免疫小鼠的脾細胞，以10:1的比例混合置于融合管中，在45 s內(nèi)加入1 mL預熱的PEG，作用90 s后，加入30～40 mL預熱的不完全DMEM培養(yǎng)基，終止反應(yīng)。在37℃培養(yǎng)箱中靜置10 min后離心，棄上清后用含20% 胎牛血清（FBS）的HAT完全培養(yǎng)基重懸細胞，將融合細胞懸液滴加到鋪有小鼠腹腔巨噬細胞的96孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后注意觀察細胞生長情況，融合后d7補加HAT培養(yǎng)基，觀察融合細胞生長狀況。約10～15 d后，待雜交瘤細胞布滿孔底約1/5面積時，吸取細胞上清供抗體檢測。1.3.3 雜交瘤細胞的初步篩選 鏡檢觀察培養(yǎng)孔中細胞克隆生長情況，對孔中細胞克隆不超過3個的進行標記，吸取細胞上清，然后通過間接ELISA測定抗體分泌情況。具體步驟：以0.5 μg/mL SPZ-BSA

包被酶標板，4℃過夜，用PBST（0.05% Tween-20 PBS溶液）洗滌3～4次，每次3 min，然后加200 μL明膠（10 g/L），37℃ 封閉3 h，同上洗滌。加入待測細胞上清10 μL，用抗體稀釋液（含5% 小牛血清的PBST）補液至100 μL，陰性對照加100 μL抗體稀釋液，37 ℃孵育1.5 h，同上洗滌。每孔加入100 μL 按1:2000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1.5 h，同上洗滌。每孔加入100 μL新配制TMP底物顯色液，37℃避光反應(yīng)10～15 min，然后加入50 μL硫酸溶液（2 mol/L）終止反應(yīng)，測量OD450值，P/N≥2.1為陽性。

從陽性克隆中去除其分泌抗體對蛋白載體有反應(yīng)的克隆，分別以SPZ-OVA、BSA和OVA包被，對陽性克隆再次篩選，將僅對SPZ-BSA顯色的孔判為陽性。

1.3.4 對細胞陽性克隆進行亞克隆及藥物競爭抑制篩選 對上述陽性細胞克隆挑選OD450值高且生長狀態(tài)好的陽性克隆按有限稀釋法進行亞克隆，同時用ci-ELISA進行第三次篩選，步驟如下：以0.025 μg/ mL SPZ-BSA包被過夜，37℃封閉酶標板。取陽性細胞上清2 μL用1 mL抗體稀釋液稀釋，稱取一定量SPZ用PBS稀釋成1000、500 、0 ng/mL的SPZ標準溶液，在反應(yīng)孔中依次加入不同濃度SPZ標準溶液和稀釋的細胞上清各50 μL，其余操作同間接ELISA，得到各反應(yīng)孔OD450值并計算抑制率。將篩選出的抑制率高的細胞株按有限稀釋法繼續(xù)進行亞克隆，經(jīng)多次亞克隆，待細胞上清陽性率為100%時，建株并對細胞擴大培養(yǎng)，液氮保存。

1.3.5 腹水單克隆抗體的制備 取8周齡BALB/c雌性小鼠提前3周腹腔注射石蠟油，每周1次，0.5 mL/只。將擴大培養(yǎng)的雜交瘤細胞用葡萄糖生理鹽水重懸，于第4周腹腔接種小鼠，約106個細胞/只。接種后每天觀察小鼠狀態(tài)，約10 d后可觀察到小鼠精神萎靡，腹部膨大。待小鼠瀕死不動時用針頭收集腹水，離心取上清，－70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單抗型及亞型鑒定用SouthernBiotech亞型鑒定試劑盒鑒定腹水單抗亞型。按試劑盒說明書操作。

1.5 單抗（MAb）特性分析

1.5.1 MAb的IC50的確定 首先用棋盤法篩選出最適包被原濃度（0.01 μg/mL）和抗體稀釋倍數(shù)大致范圍，進一步用間接ELISA確定抗體稀釋倍數(shù)，在此基礎(chǔ)上建立間接競爭ELISA（ci-ELISA）。具體步驟：用SPZ-BSA 0.01 μg/mL包被酶標板，4℃包被過夜，37℃封閉。用PBS稀釋SPZ標準品，濃度依次為4000、2000、1000、500、200、100、20、0 ng/mL，取上述液體各50 μL，加最適濃度的單抗50 μL，其余步驟同1.3.3。同樣濃度做3個重復，取平均值繪制曲線，計算SPZ半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50。

1.5.2 MAb特異性分析 用ci-ELISA的方法檢測MAb與其他磺胺藥物的交叉反應(yīng)。稱取一定量的磺胺氯吡嗪鈉（SPZ）、磺胺嘧啶鈉（SD）、磺胺對甲氧基嘧啶鈉（SMDZ）、磺胺氯噠嗪鈉（SCP）、磺胺甲氧噠嗪鈉（SMX）和磺胺二甲嘧啶鈉（SM2），用PBS稀釋成不同濃度的溶液，進行ci-ELISA測試。根據(jù)擬合線性曲線方程，計算各藥物IC50，然后計算藥物交叉反應(yīng)率（CR）。

交叉反應(yīng)率= （產(chǎn)生50%抑制時SPZ的濃度/產(chǎn)生50%抑制時其他藥物的濃度）×100%。

2 結(jié)果

2.1 人工抗原紫外掃描將SPZ-OVA、SPZ和OVA溶液進行紫外掃描。SPZ 在256 nm和330 nm處有兩個吸收峰，OVA在278 nm處有吸收峰，偶聯(lián)物除256 nm和330 nm兩處吸收峰外，在380～400 nm有吸收峰，為新生成的偶氮基團的吸收峰，初步證明藥物偶聯(lián)成功。

2.2 陽性雜交瘤細胞篩選結(jié)果細胞融合后，從陽性克隆中挑選出分泌抗體僅針對SPZ-BSA且OD值高的11株雜交瘤細胞，進行2～4次亞克隆，用ci-ELISA進行競爭抑制篩選，從中篩選抑制率高的5株細胞（表1）。對其多次傳代并檢測，得到3株穩(wěn)定分泌SPZ抗體的雜交瘤細胞株，分別為F7C10、F10D9和E11C8。將這3株細胞擴大培養(yǎng)腹腔接種小鼠，收集腹水。對腹水單抗檢測，挑選出高特異性的抗體F10D9，簡稱D9，來進行抗體特性的鑒定。

2.3 MAb亞類分型腹水單抗MAb D9能和羊抗鼠IgM-HRP結(jié)合顯色，所以MAb類型為IgM，輕鏈類型為κ（表2）。

2.4 MAb特性鑒定

2.4.1 MAb IC50的確定

2.4.1.1 MAb最佳稀釋倍數(shù)確定 在最佳包被原濃度下，將腹水單抗梯度稀釋，用間接ELISA確定單抗最佳工作濃度。當包被原的濃度為0.01 μg/mL時，對應(yīng)的MAb D9工作濃度為1:4×105。

2.4.1.2 ci-ELISA標準曲線的建立 在最佳包被原濃度（0.01 μg/mL）和抗體工作濃度（1:4×105）的基礎(chǔ)上建立ci-ELISA，對系列濃度稀釋的SPZ用 ci-ELISA進行測定，以SPZ空白對照孔OD450值為B0，不同濃度的SPZ競爭反應(yīng)孔OD450值為B，以B/B0值為縱坐標，SPZ質(zhì)量濃度（ng/mL）的對數(shù)值為橫坐標，繪制標準曲線。SPZ在20～4000 ng/mL范圍內(nèi)，B/B0值與SPZ濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系，方程為y=-0.3369x+1.347，R2=0.994， IC50=326 ng/ mL。

2.4.2 MAb特異性鑒定 MAb D9與磺胺甲氧噠嗪（SMX）無交叉反應(yīng)（CR＜0.01%），而與其余供試藥品有較弱交叉反應(yīng)（CR＜10%）（表3）。

3 討論

磺胺類藥物具有抗菌譜廣、價格低廉、使用方便等特點，因而在畜禽生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，而藥物的不規(guī)范使用或過量使用會造成動物性食品中藥物殘留，引起系列人類健康問題，如產(chǎn)生耐藥性、過敏或毒性反應(yīng)[12]。因此，食源性產(chǎn)品中磺胺藥物殘留的檢測具有必要性。

目前檢測磺胺氯吡嗪鈉主要采用儀器聯(lián)用技術(shù)，如液質(zhì)聯(lián)用LC-MS/MS、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法、薄層色譜分析法等，靈敏度可滿足檢測要求，其中LC-MC 的最低檢測限（LOD）可達到650 ng/ kg[12]。與理化分析技術(shù)相比免疫學檢測具有高靈敏度和易操作的特點，在藥物殘留檢測方面具有廣闊應(yīng)用前景。本研究以制備的單抗McAb D9 建立的ELISA方法，線性范圍在20～4000 ng/mL之間。盡管我國對磺胺氯吡嗪鈉最大殘留限量沒有具體規(guī)定，但明確規(guī)定磺胺類藥總殘留最大殘留限量為0.1 mg/kg (相當于100 ng/mL)。因而，本研究建立的ELISA對于磺胺氯吡嗪鈉超標殘留陽性樣本可進行有效檢測，但靈敏度有待提高，可用化學發(fā)光免疫分析技術(shù)(CLIA）建立更高靈敏度的檢測方法[13]。

藥物小分子沒有免疫原性，SPZ通過和載體蛋白偶聯(lián)形成完全抗原，才能激發(fā)宿主產(chǎn)生相應(yīng)抗體。本研究制備的SPZ-OVA免疫小鼠后，小鼠可產(chǎn)生特異性抗體，其效價可達到1:6.4×104，證明合成的人工抗原具有良好的免疫原性。McAb D9對SPZ IC50值為326 ng/mL，與文獻[14]報道的SPZ單克隆抗體的IC50類似。由McAb D9的交叉反應(yīng)實驗可知，所制備的抗體對SPZ的特異性比較強，與其他磺胺藥有較弱或無交叉反應(yīng)。本研究對磺胺母核的氨基用重氮化方法以-N=N-與OVA相聯(lián)，因氨基可能是磺胺母核的重要抗原表位，以SPZ的氨基為偶聯(lián)基團的抗原制備的抗體，因失去重要表位而對具有磺胺母核的其他磺胺藥幾乎沒有交叉反應(yīng)，也可能因為SPZ以磺胺母核端與蛋白載體相連，不能在抗原分子表面突出磺胺母核而被免疫活性細胞最大限度地識別所致。為此，若研制檢測磺胺類藥的試劑盒，可考慮以磺胺母核為基礎(chǔ)設(shè)計半抗原，并設(shè)法突出于抗原表面，研制類特異性抗體，這種研究思路已有研究表明是可行的[15]。

本研究采用有限稀釋法[16]進行融合細胞的亞克隆化，即將待克隆的細胞團在顯微鏡下標記，用移液槍將細胞吸出，置于96孔細胞板中稀釋，在顯微鏡下計數(shù)，選取細胞數(shù)約為100個/孔，將該孔細胞加至10 mL培養(yǎng)基中，充分混勻后加至鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板中進行培養(yǎng)。采用這種方法單克隆率比較高，同時縮短了亞克隆的周期，簡單有效。本研究通過對雜交瘤細胞進行篩選后得到的單克隆抗體的效價和特異性對比免疫血清多抗都有了很大提高。

[1] 陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學 [M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002: 227-234.

[2] 中國獸藥典委員會.獸藥使用指南（化學藥品卷）[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005.

[3] 黃兵, 朱順海. 幾種藥物抗小鼠弓形蟲感染的初步效果[J]. 中國動物傳染病學報, 2010, 18(3): 45-50.

[4] 袁中珍. 動物源性食品中16種磺胺類藥物殘留的測定[D]. 重慶: 重慶醫(yī)科大學, 2013.

[5] Commission of the European Communities. Establishment by the European Community of maximum residue limits (MRLs) for residues of veterinary medical aproducts in foodstuffs of animal origin[Z]//The rules governing medical products in European Community VI, ECSCEEC-EAEC, Brussels, Belgium,1991.

[6] FDA. FDA announces final decision about veterinary medicine[EB/OL]. FDA News, 2005-07-28.

[7] Vandenheuvel W J, Gruber V F. N-dimethylaminomethylene derivatives for the gas-liquid chromatography of primary sulfonamides[J]. J Chromatogr,1975, 112: 513-521.

[8] Sun H, Ai L, Wang F. Quantitative analysis of sulfonamide residues in natural animal casings by HPLC [J]. Chromatographia, 2007, 66(5): 333-337.

[9] Gehring T A, Griffin B, Williams R, et al. Multiresidue determination of sulfonamides in edible catfish, shrimp and salmon tissues by high-performance liquid chromatography with postcolumn derivatization and fluorescence detection[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2006, 840 (2): 132-138.

[10] Arroyo-Manzanares N, GáMiz-Gracia L, García-Campa?a A M. Alternative sample treatments for the determination of sulfonamides in milk by HPLC with fluorescence detection[J]. Food Chem, 2014,143: 459-464.

[11] Maudens K E, Zhang G F, LaMbert W E. Quantitative analysis of twelve sulfonamides in honey after acidic hydrolysis by high-performance liquid chromatography with post-column derivatization and fluorescence detection[J]. J Chromatography A, 2004, 1047(1): 85-92.

[12] 高嶸, 張琦. 高效液相色譜法鑒定豬肉組織中磺胺類藥物的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢疫雜志, 2007, 17(10): 1805-1806 .

[13] 宋寧寧. 呋喃妥因代謝產(chǎn)物AHD單抗的制備及其快速檢測技術(shù)的研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學院, 2012.

[14] 李銀生, 王秀紅. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞肉或雞蛋中長線抗球蟲類藥物殘留[J]. 上海交通大學學報（農(nóng)業(yè)科學版）, 2011, 29(6): 16-23.

[15] 王振華. 磺胺氯吡嗪單克隆抗體的制備[D]. 洛陽: 河南科技大學, 2012.

[16] 杜玉玲, 常迪. 磺胺母核單克隆抗體的制備及其免疫學特性研究[J]. 中國食品學報, 2013, 13(12): 139-145.

[17] 龔鵬飛, 王權(quán), 陳永軍. 孔雀石綠單克隆抗體的制備及其鑒定[J]. 中國獸醫(yī)科學, 2007, 37(4): 395-362.

GENERATION OF A MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST SULFACHLOROPYRAZINE SODIUM

ZHANG Meng1, LIU Ying-chun1, JIANG Wei1, CHEN Yong-jun1, ZHANG Hua-jing1, XUE Jun-xin1,2, GONG Feng-ju1,2, ZENG Peng1,2, WANG Min-yan1, WANG Quan1
(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this study, sulfachloropyrazine sodium (SPZ) was conjugated with ovalbumin (OVA) for preparation of immune antigen through diazotization method. The artif cial antigen (SPZ-OVA) was used to immunize BALB/c mice. After fourth immunization, mouse serum samples were collected and antibodies were titrated to be 1:6.4×104in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The mouse with higher titer was sacrif ced and spleen was collected for hybridoma production. The hybridoma cells were screened for antibody production in ELISA. One positive hybridomas D9 was obtained and subcloned by limited dilution. A stable antibody-producing clone was then identif ed and propagated. The mouse ascites containing monoclonal antibodies were produced and tested for ELISA titer and half inhibition concentration (IC50). As a fact, the MAb D9 had ELISA titer at 1:4×105and half inhibition concentration (IC50) at 326 ng/mL.

Sulfachloropyrazine sodium; monoclonal antibody; indirect competitive ELISA

S859.795

A

1674-6422（2015）03-0036-06

2015-03-23

上海市技術(shù)標準專項 (13DZ0502701)

張夢，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

王權(quán)，E-mail：wangquan@shvri.ac.cn