血清15型鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及交叉免疫保護研究

姜安安，王小蘭，王少輝，韓先干，丁 鏟，王桂軍，于圣青

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學，合肥 230036；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

血清15型鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及交叉免疫保護研究

姜安安1,2，王小蘭2，王少輝2，韓先干2，丁 鏟2，王桂軍1，于圣青2

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學，合肥 230036；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

本研究對安徽省某鵝場急性死亡的雛鵝進行了細菌分離鑒定，無菌采集病死鵝肝臟、腦和心包液，經(jīng)過培養(yǎng)特性觀察、染色鏡檢、生化特性檢測以及16S rRNA和血清學檢測，鑒定病原菌為血清15型鴨疫里默氏桿菌，命名為LAG1株。該分離菌株對四環(huán)素類藥物敏感，而對卡那霉素等耐藥；對雛鴨的致病性強，半數(shù)致死量（LD50）測定為7.75×103CFU/只；交叉免疫保護試驗結果顯示LAG1滅活油乳劑疫苗對自身菌株攻毒的免疫保護率可達80%以上，對血清10型鴨疫里默氏桿菌HXb2攻毒的保護率可達70%，對血清1型鴨疫里默氏桿菌WJ4和血清2型鴨疫里默氏桿菌Yb2攻毒的保護率低于20%。本研究結果可為安徽省養(yǎng)鵝業(yè)鴨疫里默氏桿菌病的防治工作提供參考。

鴨疫里默氏桿菌；分離；鑒定；鵝

鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎, 是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)引起的一種侵害雛鴨、雛鵝、雛火雞等多種禽類的急性或慢性傳染病，以氣囊炎、心包炎、肝周炎為主要病變[1]。該病最早于1904年由Riemer[2]發(fā)現(xiàn)于鵝群中,隨后美國學者Hendrikson 和Hibert[3]于1932年在紐約長島的鴨場中發(fā)現(xiàn)并報道了該病的發(fā)生。1975 年鄺榮祿等首次報道中國廣東市存在鴨疫里默氏桿菌病，1982 年郭玉璞等[4]從北京市郊區(qū)某鴨場首次分離到RA[4]。此后我國各省市陸續(xù)有RA感染的病例報道。

鴨疫里默氏桿菌病的流行無明顯的季節(jié)性, 一年四季均可發(fā)生，但在低溫陰雨、潮濕、寒冷的環(huán)境更易誘發(fā),主要發(fā)生于12～30日齡雛鴨。2013年7月中旬安徽省六安市某鵝場的46日齡雛鵝發(fā)病，發(fā)病急且發(fā)病3 d左右死亡，死亡率約為20%。主要癥狀為白色或綠色拉稀，腳掌發(fā)黃無血色，頭頸扭曲震顫等，剖檢可見纖維素性心包炎和肝周炎。為了對其病原進行確診，采集病死雛鵝的心包液、肝臟和腦組織進行了細菌分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料來源2013年7月中旬對安徽省六安市某鵝場46日齡病死雛鵝，無菌采集心包液、肝臟和腦組織。

1.2 試驗材料兔鮮血培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基按常規(guī)方法自行制備后保存于4℃冰箱備用；細菌生化微量發(fā)酵管為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB-YE）、胎牛血清、V-P試劑、MR試劑、吲哚試劑、硝酸鹽試劑均購自紹興天恒生物科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix 購自天根生化科技（北京）有限公司；Montanide ISA 71VG購自法國SEPPIC公司。

1.3 細菌的分離培養(yǎng)無菌條件下采取病死雛鵝的心包液、肝臟和腦組織, 分別接種于血瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后觀察細菌的生長。

1.4 細菌形態(tài)觀察取血瓊脂平板上經(jīng)過純化的單個菌落, 革蘭氏染色鏡檢。

1.5 生化試驗取血瓊脂平板上單個菌落分別接種于系列生化反應管和生化培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)24～48 h,觀察結果。

1.6 RA 16S rRNA檢測使用PCR方法擴增RA的16S rRNA并測序，對病原菌進一步鑒定。挑取分離菌的單個菌落接種TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。吸取1 mL菌液用煮沸法提取細菌DNA，作為擴增模板,使用特異性引物P1（5'- GAGCGGTAGAGTA TCTTCGGATACT-3'）和P2（5'- AATTCCTTTGAG TTTCAACCTTGCG -3'）進行RA 16S rRNA擴增。PCR反應體系（50μL）：滅菌ddH2O 18.5μL、2×Taq PCR Master Mix 25μL、上下游引物P1/P2各2μL、模板2.5μL。PCR反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，50℃退火 40 s，72℃延伸1 min的循環(huán)程序進行30次循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。將擴增產(chǎn)物送至上海邁浦生物科技有限公司測序，測序后經(jīng)BLAST進行序列分析。

1.7 血清型鑒定RA血清1型、2型、6型、10型和15型兔抗血清，按照玻片凝集試驗方法，采集對分離菌株進行血清型鑒定。上述各型兔抗血清均由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所畜禽細菌性傳染病研究實驗室制備并保存。

1.8 藥敏試驗采用藥敏紙片擴散法, 對分離菌株進行藥敏試驗, 37℃恒溫培養(yǎng)24 h觀察結果。

1.9 半數(shù)致死量（LD50）測定將分離菌株接種到TSB 中，置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至OD600值為1。采用10倍倍比稀釋法將菌液計數(shù)并稀釋至含菌量為107、106、105、104、103CFU/mL，各稀釋度分別腿部肌肉接種15日齡櫻桃谷鴨 6只，0.5 mL/只。接種后對發(fā)病死亡情況連續(xù)觀察記錄 1 周。

1.10 交叉免疫保護性測定滅活LAG1油乳劑疫苗制備：將分離菌株LAG1進行培養(yǎng)、純度檢測及細菌計數(shù)。在細菌的對數(shù)生長期按體積比加入0.4%福爾馬林，37℃、200 r/min振蕩15 h進行滅活。滅活后取樣接種于TSA平板，37℃、5% CO2靜置培養(yǎng)24 h，無菌檢驗后制備滅活LAG1油乳劑疫苗。取含菌量

為6.7×1010CFU/mL的滅活菌液，按照3:7的比例加入Montanide ISA 71VG，高速攪拌乳化后分裝，100 mL/瓶，室溫保存。制備好的疫苗接種于TSA平板，37℃、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，檢查有無細菌生長。

將56只5日齡健康櫻桃谷雛鴨平均分成8組，每組7只，其中1～4組為免疫攻毒組，5～8組為非免疫攻毒對照組。對免疫攻毒組的雛鴨采用頸部皮下接種方法進行免疫，免疫劑量為109CFU/0.5 mL/只，2 周后同法加強免疫 1 次。對照組不做任何免疫接種處理。二次免疫14 d后，分別使用血清1型強毒株WJ4、血清2型強毒株Yb2、血清10型強毒株HXb2和自身菌株LAG1對免疫雛鴨組（1～4組中隨機選1組）和非免疫雛鴨組（5～8組中隨機選1組）進行腿部肌肉注射攻毒，攻毒劑量為10 LD50。具體攻毒菌數(shù)分別為：WJ4，5×108CFU/只；HXb2，103CFU/只；Yb2，106CFU/只；LAG1，7.75×104CFU/只。WJ4株、Yb2株和HXb2株由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所畜禽細菌性傳染病研究實驗室分離鑒定并保存。

2 結果

2.1 鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定

2.1.1 培養(yǎng)特性及細菌形態(tài) 分離菌株在普通瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長，在血瓊脂培養(yǎng)基上可長成直徑約為1 mm的菌落, 凸起、濕潤、光滑、呈露珠狀。革蘭氏染色鏡檢細菌為革蘭氏陰性小桿菌，多呈單個散在排列。將該細菌分離株命名為LAG1。

2.1.2 生化特性 LAG1不發(fā)酵糖類和醇類，脲酶試驗和氧化酶還原試驗為陽性，不還原硝酸鹽，不液化明膠，V-P試驗、MR試驗、吲哚試驗均為陰性。詳細結果見表1。

2.1.3 RA 16S rRNA檢測 PCR 擴增獲得1條約500 bp的基因片段（圖1），測序后用BLAST進行分析。該基因片段與GenBank中已登錄的RACH-2（登錄號：CP004020.1）、RA-GD（登錄號：CP002562.1）、DSM 15868（登錄號：CP002346.1）、CH3（登錄號：CP006649.1）、RA-CH-1（登錄號：CP003787.1）和ATCC 11845（登錄號：CP003388.1）菌株的16S rRNA序列同源性高達99%，因此鑒定LAG1分離株為鴨疫里默氏桿菌。

2.1.4 血清型鑒定 血清凝集試驗表明LAG1分離株與RA15型兔抗血清呈陽性反應，與RA 1、2、6和10型兔抗血清呈陰性反應， 因此鑒定LAG1為血清15型RA分離株。

2.2 藥敏試驗 判斷標準參考藥敏紙片生產(chǎn)商杭州微生物試劑有限公司提供的判斷標準：低于中介度為低敏或耐藥，高于中介度為高敏，處于中介度范圍內(nèi)為中敏。結果顯示分離菌株對β－內(nèi)酰胺類，四環(huán)素類，大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感度較高；對氨基糖苷類藥物中度敏感；對氯霉素類耐藥。藥敏試驗結果詳見表2。

2.3 半數(shù)致死量（LD50）測定采用累積法[5]計算LAG1菌株的LD50

累積數(shù)中的動物數(shù)=本組動物所有數(shù)+所有大劑量組存活數(shù)+所有小劑量組死亡數(shù)

累積數(shù)中的死亡數(shù)=本組死亡數(shù)+所有小劑量組死亡數(shù)

1)求死亡率每相差1 %時，劑量差：

（103×103-103）/（60%-20%）= 2.25×104

2)求LD50劑量

LAG1=60%-50%=20%

104-2.25×104×20%=5.5×103CFU/只

即LAG1菌標的LD50=7.75×103CFU/只

經(jīng)計算LAG1菌株的LD50=2.25×104CFU/只。

2.4 交叉免疫保護試驗交叉免疫保護試驗結果顯示LAG1株對自身菌株的保護率最高為85.7%，其次對血清10型的HXb2株的保護率較好為71.4%，對血清1型 WJ4株和血清2型Yb2株幾乎無保護力。詳細結果見表4。

3 討論

從安徽省某鵝場分離的細菌, 通過流行病學、剖檢病變、細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗和16S rRNA基因測序鑒定為RA，命名為LAG1。

不同來源的RA，其生化特性不完全相同[6]。通常認為RA不發(fā)酵碳水化合物,如糖類,但也有少數(shù)菌株可發(fā)酵果糖、麥芽糖、葡萄糖等。本研究結果表明LAG1菌株不發(fā)酵糖類和醇類，不產(chǎn)生硫化氫,不能利用枸櫞酸鹽,不能還原硝酸鹽，不液化明膠，吲哚試驗和甲基紅陰性，但是脲酶和觸酶試驗結果為陽性，這些特性與已報道的RA生化特性十分相似。RA在臨床上能引起心包炎、肝周炎，與大腸桿菌的臨床病理變化十分相似，但是二者的生化特性相去甚遠。通常大腸桿菌可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇等多種糖類和醇類，并且吲哚試驗和甲基紅試驗均為陽性。

鴨疫里默氏桿菌病尚無有效的疫苗用于預防，臨床上多使用抗菌藥物防治。本研究的藥敏試驗結果顯示，LAG1菌株對β-內(nèi)酰胺類藥物，四環(huán)素類

藥物，大環(huán)內(nèi)酯類藥物高度敏感；對氨基糖苷類藥物中度敏感；對氯霉素藥物耐藥，與蔡秀磊等[7]的報道相符合。對1999～2005年從浙江省分離獲得的22株RA進行藥敏試驗，結果顯示對紅霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素敏感，對卡那霉素、青霉素、新霉素、丁胺卡那不敏感。Sun等[8]對103株RA的耐藥表型及耐藥基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)RA存在β-內(nèi)酰胺酶 基 因（blaCMY-2、blaTEM、blaSHV、blaDHA blaCTX-M），氨基糖苷類耐藥基因（aac(3’)-Ia、aac(3’)-IIc, aac(3’)-IV、aph(2’)-Ib、aph(3’)-II、aph(3’)-IV、aph(3’)-VII、aph(4’)-Ia、aadA1、aadA2、aadB、aac(6’)-Ib、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、armA、npmA），氯霉 素 和氟苯尼考耐藥基因（cat1、cat2、cmlA、cmlB、floR），四環(huán)素耐藥基因（tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(K)、tet(M)），磺胺類耐藥基因（sul1、sul2、sul3）等多種耐藥基因，在眾多耐藥表型中RA對氨基糖苷類藥物耐受性最強，這表明在治療RA感染時正確選擇抗生素十分重要。

RA血清型呈多態(tài)性，據(jù)報道我國境內(nèi)存在25種血清型[9]。張大丙等[10]對2400多株RA進行分析，認為1、2、6、10 型是我國許多地區(qū)主要流行的血清型。RA15型最初由Sandhu &Leister（1991）在美國報道，但其菌株來自于新加坡，在新加坡有較高的分離率[11]，而在其他國家和地區(qū)很少發(fā)現(xiàn)。中國張大丙等[12]2002年首次分離到了[12]，此后鮮有該血清型菌株的分離報道。

RA的毒力差異很大，即使是相同血清型但不同分離菌株之間仍有非常大的差異。該研究分離獲得的血清15型RA LAG1菌株，對雛鴨致病力較強，在104CFU攻毒劑量條件下可出現(xiàn)過半數(shù)的死亡。RA各血清型間的交叉保護性較差，通常不能提供有效的保護力。本研究表明以LAG1株制備的滅活油乳劑疫苗在二次免疫14 d后，對1型強毒W(wǎng)J4、2型強毒Yb2攻擊的保護力較差，僅14.2%；而對10型強毒HXb2的攻擊可提供71.43%的免疫保護率，略低于對自身菌株LAG1攻毒保護。國內(nèi)外對RA疫苗都多有研究。Sandhu等[13]針對美國優(yōu)勢血清型流行菌株研制了血清 1、2、5 型 RA三價福爾馬林滅活苗；高福等[14]研制了血清1型RA礦物油佐劑滅活疫苗；蘇敬良等[15]研制了血清1、2型RA 二價油乳劑滅活疫苗；程安春等[16]研制了血清1、2、4、5型 RA鋁膠復合佐劑四價滅活疫苗。但是鑒于RA血清型的多樣性，流行情況的復雜性及各血清型之間交叉免疫的缺乏性，且現(xiàn)有的疫苗多針對地區(qū)優(yōu)勢血清型研制，對非優(yōu)勢血清型如15型RA保護力不佳。近年來江蘇省[17]，福建省[18]，四川省[19]，貴州省[20]等地均有關于雛鵝感染RA的報道，這提示對血清15型等非優(yōu)勢血清型RA的防制應引起水禽養(yǎng)殖業(yè)的重視。

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ISOLATION, IDENTIFICATION AND CROSS-PROTECTION OF A GOOSEORIGIN RIEMERELLA ANATIPESTIFER SEROTYPE 15 ISOLATE

JIANG AN-an1,2, WANG Xiao-lan2, WANG Shao-hui2, HAN Xian-gan2, DING Chan2, WANG Gui-jun1, YU Sheng-qing2
(1.Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)

The aim of this study was to investigate the pathogen of acute death goose from a goose farm in Anhui Province. One bacterial strain named as LAG1 was isolated and identified as a Riemerella anatipestifer serotype 15 isolate through observation of bacterial culture characteristics, characterization of bacterial biochemical properties, amplif cation of bacterial 16S rRNA and determination of bacterial serotype. Drug sensitivity assay showed that the LAG1 was sensitive to tetracycline, but resistant to kanamycin antibiotics. The isolate was highly pathogenic to ducks, and the median lethal dose (LD50) was determined as 7.75×103colony forming units (CFU) when measured in 12-day-old ducks. Animal protection experiment showed that the ducks immunized with inactivated LAG1 oil-emulsion vaccine could obtain prodection rate of more than 80% from challenges with serotype 15 strain LAG1, and 70% from serotype 10 strain HXb2, and less than 20% from challenges with serotype 1 strain WJ4 and serotype 2 strain Yb2. The challenge doses for strains LAG1, HXb2, WJ4 and Yb2 were all set as 10 LD50. Our result will benef t for the control of R. anatipestifer infection in goose breeding industry in Anhui Province.

Riemerella anatipestifer; isolation; identif cation; goose

S852.612

A

1674-6422（2015）03-0017-07

2015-05-15

國家自然科學基金（31272591）；農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201303044)

姜安安，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

王桂軍，E-mail: wangguijun@ahau.edu.cn； 于圣青，E-mail: yus@shvri.ac.cn