錦鯉皰疹病毒病的研究進(jìn)展

袁海延，于慧，王好，周井祥，張瑞雪，劉建平，馬躍，王釗

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春130118）

錦鯉皰疹病毒病的研究進(jìn)展

袁海延，于慧，王好，周井祥?，張瑞雪，劉建平，馬躍，王釗

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春130118）

就錦鯉皰疹病毒病的病原學(xué)、流行病學(xué)特征、臨床癥狀、檢測(cè)方法和防治技術(shù)方面取得的成果進(jìn)行了綜述，為研究和預(yù)防錦鯉皰疹病毒病提供參考。

錦鯉皰疹病毒；分子生物學(xué)；檢測(cè)方法；防治技術(shù)

錦鯉皰疹病毒?。↘oi Herpesvirus Diease，KHVD）是由錦鯉皰疹病毒（Koi Herpesvirus，KHV）引起的一種高傳染性和高致死性的疾病，主要感染錦鯉、普通鯉魚及其變種。1998年首次從美國和以色列的患病鯉魚和錦鯉中分離出來并被證實(shí)。2001年香港首次爆發(fā)該疾病，最近已入侵了東南亞許多國家的初始種群。KHVD在2006年被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必需報(bào)告的疾?。?］，但由于其發(fā)展史較短，有關(guān)KHVD的病原體、診斷方法及相關(guān)防疫措施的研究相對(duì)較少。本文就KHVD的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為錦鯉皰疹病毒病的后續(xù)研究提供參考。

1 病原體--KHV

1.1 KHV的分類和命名 最初由于KHVD臨床癥狀主要是腎臟出血紅腫和鰓壞死病變，被稱為鯉魚間質(zhì)性腎炎和鰓壞死病毒（CNGV），后最終被命名為錦鯉皰疹病毒（KHV）［2］。KHV為皰疹病毒科（Herpesviridae），鯉皰疹病毒屬（Cyprinid herpesvirus），又稱鯉皰疹病毒3型（CyHV-3），與鯉痘瘡病毒（鯉皰疹病毒1型，CyHV-1）和金魚造血器官壞死病毒（鯉皰疹病毒2型，CyHV-2）同屬。KHV形態(tài)特征與其他兩種魚類皰疹病毒類似，但在臨床癥狀、宿主范圍、抗原性、生長(zhǎng)特性和細(xì)胞病變類型等方面不同于二者［3］。

1.2 KHV分子生物學(xué)特性 KHV屬于皰疹病毒目（Herpesvirales）中的魚類皰疹病毒科（Alloherpesviri?dae）［4］，是一種較大的線性、雙鏈DNA病毒，基因組大小為295 kb，末端含有22個(gè)正向重復(fù)序列，共有156個(gè)開放性閱讀框（ORF）和8個(gè)末端重復(fù)序列，GC含量占全部核苷酸的59.2%。成熟的病毒粒子呈球形，直徑約為170～230 nm，主要由囊膜，皮層，衣殼，核心組成。核衣殼是直徑為110 nm左右的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，外有囊膜結(jié)構(gòu)包裹。病毒核表面有螺紋結(jié)構(gòu)，核內(nèi)有一不對(duì)稱的電子致密區(qū)域，被認(rèn)為是病毒基因組組成的核蛋白［5］。

1.3 KHV基因組結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展 目前，對(duì)KHV的主要基因型已經(jīng)確定，其全基因組的結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的功能的研究較為滯后。僅個(gè)別較保守的ORF的功能已經(jīng)確定，并被成功克隆。

1.3.1 結(jié)構(gòu)蛋白 2010年，Michel B等人利用質(zhì)譜的方法已確定KHV成熟病毒粒子由40種蛋白質(zhì)組成，包括3個(gè)核衣殼蛋白（ORF72、ORF78、ORF92）、13個(gè)囊膜蛋白（ORF25、ORF32、ORF59、ORF65、ORF81、ORF99、ORF108、ORF115、ORF131、ORF132、ORF136、ORF148、ORF149）、2個(gè)間質(zhì)蛋白（ORF62、ORF132）以及22個(gè)未分類蛋白［5］。但是只有個(gè)別基因經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證其功能。2012年，李新偉克隆出編碼膜糖蛋白的ORF25和囊膜蛋白ORF81基因，并成功構(gòu)建核酸疫苗［6］。ORF25表達(dá)蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中，是KHV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好免疫原性［7］。ORF81［8］基因表達(dá)囊膜蛋白，含有四個(gè)跨膜區(qū)域，參與病毒與細(xì)胞融合及病毒對(duì)細(xì)胞的吸附、穿入和釋放。

1.3.2 非結(jié)構(gòu)蛋白 根據(jù)蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)可分為5個(gè)家族：ORF2家族、TNFR（腫瘤壞死因子受體）家族、ORF22家族、ORF25家族和Ring家族。ORF2家族包括ORF2和ORF9，其中ORF2［9］基因表達(dá)膜蛋白。TNFR家族包括ORF4和ORF12。TNFR家族的兩個(gè)基因（ORF4／12）編碼的蛋白具有TNFRmotif.ORF25家族編碼6個(gè)膜蛋白（ORF25［6-7］、ORF26、ORF27、ORF65［7］，ORF148和ORF149）；RING家族共編碼四個(gè)蛋白（ORF41、ORF128、ORF144、ORF150）均含有鋅指結(jié)構(gòu)（RING Finger）特征基序。

KHV的主要毒力基因可能為TK基因［10］，對(duì)應(yīng)ORF55，編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶。其功能為催化脫氧胸腺嘧啶核苷酸化成dTMP，并進(jìn)一步磷酸化為dTTP，即組成DNA分子的基本成分，此外也間接參與dCTP、dGTP和dATP等物質(zhì)的合成。與病毒在宿主體內(nèi)保持潛伏感染狀態(tài)以及激活潛伏感染狀態(tài)密切相關(guān)，具有關(guān)鍵性的作用。

KHV的免疫原性蛋白5個(gè)［11］，分別為ORF56、ORF150、ORF92、ORF22和ORF23.其中ORF56為糖蛋白，ORF150為RING家族脂蛋白，ORF92為主要衣殼蛋白，ORF22為膜蛋白，ORF23編碼白介素-10。這些免疫調(diào)節(jié)基因是保守的，并且可以在逃避宿主免疫系統(tǒng)的病毒的能力中起重要作用。

2 KHVD流行病學(xué)特征

KHV感染造成錦鯉和普通鯉魚的重大死亡。這種疾病早前在以色列被稱為鯉魚間質(zhì)性腎炎和鰓壞死的疾?。–NGV）。錦鯉皰疹病毒首次于1998年在以色列和德國爆發(fā)。隨后在美國、英格蘭和荷蘭爆發(fā)被報(bào)道［1］。2002年，首次在中國廣東省發(fā)現(xiàn)該?。?2］。2011年，朱霞等利用框鏡鯉魚鰭細(xì)胞（KFC）從我國遼寧省某養(yǎng)殖的患病錦鯉分離得到該病毒［13］。如今KHVD現(xiàn)已蔓延到大多數(shù)大洲，至今為止，超過30多個(gè)國家或地區(qū)爆發(fā)該病，包括以色列、英國、德國、美國南非、波蘭［14］、捷克共和國［15］、日本［16］、澳大利亞、韓國［17］、馬來西亞、中國［18］、加拿大［9］、俄羅斯［20］、新加坡以及印度等。

KHVD感染宿主的范圍比較窄，目前只發(fā)現(xiàn)易感染錦鯉、鯉魚及其變種魚。幼魚與成魚均易感染。一般疾病的潛伏期5～7 d，特點(diǎn)是當(dāng)水溫在15～25℃范圍內(nèi)，突然發(fā)病，迅速蔓延［21］。KHVD發(fā)病最適溫度為20～25℃，30℃以上病毒會(huì)處于休眠狀態(tài)，最新研究發(fā)現(xiàn)KHV可以在冰下繁殖，發(fā)病時(shí)水溫為-2～5℃，平均3℃［22］。KHV爆發(fā)后幸存的魚帶毒，可將疾病傳染給其他魚。

3 KHVD臨床癥狀

感染KHV后的錦鯉或鯉魚的臨床癥狀與病程有關(guān)，處于不同時(shí)期的患病魚的癥狀有差異。在感染初期，體表有少量出血點(diǎn)和白斑，鱗片松動(dòng)，脫落并帶有血絲；肛門略微紅腫；眼凹陷，眼底出血；鰭條充血，尾鰭最為嚴(yán)重，臀鰭和背鰭次之；皮下和肌肉出血；打開鰓蓋，鰓絲呈深紅色，減去一條全鰓，血流量減少且凝固迅速；腸道充血發(fā)紅且硬挺，腎腫大顏色發(fā)紅，脾臟有出血點(diǎn)，膽汁的顏色較深。感染中后期出現(xiàn)精神抑郁，行動(dòng)遲緩且無方向感的游泳或停止游泳，皮膚出血及出現(xiàn)白斑和水泡，鰭條上有血絲，鰓蓋和鰓絲出血并產(chǎn)生大量粘液，患病魚在1～2 d內(nèi)死亡。KHV發(fā)病時(shí)，出現(xiàn)發(fā)病急，感染率和死亡率高等特點(diǎn)，且容易死亡的常是體態(tài)肥碩的［3］。

4 檢測(cè)方法研究進(jìn)展

由于KHV傳播快，感染率和死亡率高，潛伏時(shí)間長(zhǎng)，所以需要研究出能快速準(zhǔn)確的診斷KHV的辦法以便對(duì)魚群及時(shí)有效的處理從而控制KHV的傳播。通過常規(guī)的臨床診斷不能對(duì)錦鯉皰疹病毒病進(jìn)行確診，還需結(jié)合試驗(yàn)技術(shù)診斷方法。迄今為止，許多技術(shù)已被用于魚錦鯉皰疹病毒的檢測(cè)［23］。目前主要的診斷方法有細(xì)胞分離培養(yǎng)檢測(cè)、血清中和試驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)。

4.1 細(xì)胞分離培養(yǎng) 該病毒可在易感的魚類細(xì)胞分離，如KFC、KF-1、KT-2或CCB的細(xì)胞株。目前，國內(nèi)KHV細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟。2011年，中國中山大學(xué)何建國等人建立了一種鯉魚鰭條細(xì)胞系KCF-1，并成功分離得到了KHV［24］。同一年，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)朱霞等人也成功的分離得到了KHV［25］。

4.2 分子生物學(xué)診斷方法

4.2.1 PCR技術(shù) PCR是KHV檢測(cè)的一種更具體和敏感的方法，Nested-PCR［13］、實(shí)時(shí)PCR［26］、熒光定量PCR［27］已經(jīng)開發(fā)使用于錦鯉皰疹病毒的檢測(cè)。由于KHV含有內(nèi)含子，所以設(shè)計(jì)跨越內(nèi)含子區(qū)域的引物，使用RT-PCR［28］方法也可以準(zhǔn)確的鑒定該疾病。但是PCR方法不能用于活魚檢測(cè)。

4.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP） 經(jīng)過不斷地改良，LAMP法的敏感度和特異性越來越高。最近，Wen-Hsin等［29］建立了一個(gè)在集成微流體系中，運(yùn)用LAMP法快速分離和檢測(cè)水產(chǎn)病原的工具。該工具可以在65 min內(nèi)完成樣品前處理，LAMP程序及光學(xué)檢測(cè)的全過程，可以同時(shí)檢測(cè)四種病原體。因此，LAMP在未來可能成為快速檢測(cè)KHV的有力工具。

除了上述方法外還有ELISA方法、電鏡技術(shù)及原位雜交技術(shù)等。ELISA方法是一種間接診斷方法，可以通過檢測(cè)錦鯉和鯉魚血清中抗KHV抗體來診斷。但是，ELISA方法檢測(cè)KHV的背景值高，與CCV和CHV之間具有較高的交叉免疫反應(yīng)。另外，魚類的血清抗體水平較低，不易檢出，因此ELISA的應(yīng)用受到了一定的限制。電鏡技術(shù)及原位雜交技術(shù)所需要儀器設(shè)備非常昂貴，不適宜推廣應(yīng)用。

5 防控措施

KHVD給世界各地的鯉魚和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且一旦爆發(fā)，病情很難控制。及時(shí)采取有效的預(yù)防措施是控制該病的主要途徑。

5.1 免疫預(yù)防 防制病毒性傳染病的有效方法是疫苗免疫。目前減毒疫苗、滅活苗、核酸疫苗已經(jīng)投入使用。減毒疫苗對(duì)魚的免疫保護(hù)作用可維持至少8個(gè)月，目前已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)。滅活苗還沒有商業(yè)化生產(chǎn)。

由于滅活疫苗和減毒疫苗在穩(wěn)定性、成本及保護(hù)率方面還有許多缺點(diǎn)，所以核酸疫苗應(yīng)運(yùn)而生，通常通過克隆KHV某段序列并構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒，然后免疫試驗(yàn)動(dòng)物而獲得的特異性抗體。滅活疫苗和減毒疫苗無法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫。而核酸疫苗不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，且保護(hù)力持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。到現(xiàn)在為止，仍沒有可靠地核酸疫苗產(chǎn)生。Fuchs等［30］人生產(chǎn)的具有刪除病毒核糖核苷酸還原酶（RNR）、胸苷激酶（TK）、尿嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸酶（dUTPase）、或刪除TK和dUTP基因的重組KHV。所有的病毒突變株在培養(yǎng)細(xì)胞中均有復(fù)制能力，但TK或dUTP缺失株空斑變小，滴度降低，對(duì)鯉魚感染力衰減。所以構(gòu)建的TK或dUTP缺失株對(duì)于KHV的防控有很大的借鑒意義，可以進(jìn)一步研究KHV基因缺失疫苗。

5.2 其他防控方法 有研究［31］認(rèn)為，KHVD的流行是季節(jié)性水溫變化導(dǎo)致的，由此提出爆發(fā)的控制可以通過控制養(yǎng)殖中的水溫來實(shí)現(xiàn)，還可以通過篩選對(duì)KHV有抵抗力的雜交種和品系來降低由KHVD造成的損失，但該方法不適用于篩選有KHV抗性的觀賞錦鯉。

6 展望

當(dāng)前，KHVD已經(jīng)嚴(yán)重的威脅到了鯉魚養(yǎng)殖業(yè)，關(guān)于KHVD急需多方面深入研究，如生物學(xué)及分子生物學(xué)的深入研究、基因組每個(gè)基因功能的確定、診斷方法的研究、敏感細(xì)胞系的建立和研制有效的疫苗等。

目前，在我國關(guān)于KHVD爆發(fā)的報(bào)道并不多見。但是我們必須提高警惕，盡快建立特異、敏感、快速、適宜現(xiàn)場(chǎng)診斷的方法，加強(qiáng)進(jìn)出口口岸檢疫，控制KHVD在國內(nèi)的傳播，避免KHVD對(duì)鯉魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。

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（編輯：李文平）

Research Progress of Koi Herpesvirus Disease

YUAN Hai-yan，YU Hui，WANG Hao，ZHOU Jing-xiang?，ZHANG Rui-xue，LIU Jian-ping，MA Yue，WANG Zhao
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

The achievements of etiology，epidemiological characteristics，clinical symptoms，detection method，the prevention and control technology for the koi herpesvirus disease were summarized to provide a reference for research and prevention of koi herpesvirus disease.

koi herpesvirus；molecular biology；detection method；prevention and control technology

2015-01-16

A

1002-1280（2015）05-0062-04

S943

袁海延，碩士研究生，從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)研究。

周井祥。E-mail：zhjxnd＠126.com