基因芯片技術(shù)在雞病毒性疾病診斷中的應(yīng)用

楊國(guó)淋，文心田，曹三杰，黃小波，馬　銳，常曉霞，張　仙（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物傳染病與基因芯片實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130）

基因芯片技術(shù)在雞病毒性疾病診斷中的應(yīng)用

楊國(guó)淋，文心田，曹三杰，黃小波，馬銳，常曉霞，張仙
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物傳染病與基因芯片實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130）

禽流感、新城疫均為一類傳染病，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高；雞傳染性囊病、雞傳染性支氣管炎等也是影響我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展最為常見的疾病。目前世界各國(guó)都十分重視對(duì)這些疾病的防治，努力研究一種準(zhǔn)確、快速、特異性高的方法進(jìn)行疾病的診斷。

基因芯片技術(shù)是隨著人類基因組計(jì)劃的研究應(yīng)運(yùn)而生，又稱DNA微陣列。1986年由Dulbecco首次提出[1]，將高密度的DNA片段通過(guò)高速機(jī)械手或原位合成方式以一定的排列方式使其附著在固相表面與熒光標(biāo)記的DNA探針雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可檢測(cè)出樣品的遺傳信息。該技術(shù)具有快速、平行、高通量等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)近幾十年的發(fā)展，基因芯片技術(shù)在生命科學(xué)研究中被廣泛地用于基因表達(dá)分析、病原體的檢測(cè)、藥物篩選和疾病的診斷等領(lǐng)域[2-4]。

1　基因芯片技術(shù)的基本環(huán)節(jié)

1.1芯片的設(shè)計(jì)與制備基因芯片核酸探針序列的設(shè)計(jì)取決于研究的目的，一般從已知基因的cDNA或EST庫(kù)中選擇特異性高的探針序列，保證與待測(cè)目的基因的特異結(jié)合。基因芯片的制備是通過(guò)原位合成或點(diǎn)樣法將已知的探針序列固定在已修飾好的介質(zhì)上。介質(zhì)支持物可以是玻璃、生物膜、塑料等，玻片是目前最常用的支持物。芯片制備之前要對(duì)載體進(jìn)行修飾，使其表面有可進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活性基團(tuán)，有良好的穩(wěn)定性和生物兼容性，以便與生物分子進(jìn)行偶聯(lián)。芯片制備方法主要包括2類：（1）原位合成法：該方法于1991年由Fodor S.等[5]建立，美國(guó)Affymetrix公司率先開展了這方面的研究，該方法適用于大規(guī)模制備芯片，可以實(shí)現(xiàn)高密度芯片的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)；（2）點(diǎn)樣法：經(jīng)機(jī)械手對(duì)合成好的探針點(diǎn)樣制備芯片，該方法可以自己設(shè)計(jì)樣點(diǎn)的排列方式。

1.2靶基因的制備與標(biāo)記靶基因的制備與標(biāo)記是基因芯片流程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。由于靶基因不能與芯片探針直接雜交，待分析基因在雜交之前需以DNA、RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增核酸，然后用同位素或熒光素標(biāo)記，目前一般用熒光素Cy3 或Cy5進(jìn)行標(biāo)記[6]。近年來(lái)新發(fā)展的納米金標(biāo)記制備可視化基因芯片，放大信號(hào)后可直接用肉眼觀察結(jié)果，具有很好的靈敏度和特異性，在臨床應(yīng)用上具有重要價(jià)值[7]；由于雜交過(guò)程中是單鏈反應(yīng)，在雜交過(guò)程中雙鏈會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，影響雜交效率，目前主要應(yīng)用不對(duì)稱PCR技術(shù)來(lái)制備單鏈產(chǎn)物，提高芯片的雜交效率[8]。

1.3芯片雜交反應(yīng)芯片的雜交反應(yīng)是芯片檢測(cè)中最關(guān)鍵的一步。由于該反應(yīng)是固液雜交。所以要根據(jù)探針的長(zhǎng)度、GC含量及芯片的類型來(lái)優(yōu)化雜交條件。通常情況下，影響異源雜交雙鏈形成的因素包括樣品核酸的濃度、探針的濃度、雜交時(shí)間和溫度等多方面的條件。雜交過(guò)程要通過(guò)不斷地優(yōu)化反應(yīng)條件，使雜交的假陽(yáng)性和假陰性降到最低，從而獲得最能反映生物本質(zhì)的信號(hào)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和真實(shí)性。

1.4芯片雜交信號(hào)的檢測(cè)與分析熒光標(biāo)記的樣品核酸與芯片探針雜交后，用熒光共聚焦掃描儀掃描，采集各雜交點(diǎn)的熒光信號(hào)位置、熒光強(qiáng)弱，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析，將圖像數(shù)字化，即可獲得有關(guān)的生物信息。由于基因芯片獲取的信息量大，對(duì)基因芯片雜交數(shù)據(jù)的分析、處理、查詢、比較等需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)格式。目前，大型基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)正在構(gòu)建，目標(biāo)是將每個(gè)芯片實(shí)驗(yàn)室獲得結(jié)果集中起來(lái)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估和交流。

2　基因芯片在雞病檢測(cè)方面的主要應(yīng)用

目前，我國(guó)雞病毒性傳染病流行的主要特點(diǎn)是多病原混合感染，非典型性疫病較多，給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于雞病毒性傳染病的診斷多采用傳統(tǒng)的病原分離及常規(guī)的血清學(xué)方法進(jìn)行，但病原分離費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且敏感性和特異性都較差；血清學(xué)診斷方法也因?qū)嶒?yàn)室條件和診斷方法的不同而產(chǎn)生一定的差異。雖然PCR診斷方法已廣泛應(yīng)用于雞病毒性疾病的檢測(cè)，但只能對(duì)單一病原進(jìn)行診斷，對(duì)于混合感染的病毒病檢測(cè)比較麻煩。而近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基因芯片技術(shù)具有高通量和并行化的特點(diǎn)，可以對(duì)成百上千甚至上萬(wàn)個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，從而很好地解決了這一問題[9-11]。目前，基因芯片技術(shù)在雞病毒性疾病中的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面。

2.1基因表達(dá)譜分析基因表達(dá)譜在芯片方面的研究十分廣泛，也是芯片研究最成熟的領(lǐng)域。可對(duì)比在不同條件下基因組中大量轉(zhuǎn)錄水平的差異，也可對(duì)比不同基因組中轉(zhuǎn)錄差異的表達(dá)，由于在芯片上可以固定成千上萬(wàn)的探針，這使得眾多基因可以同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。從根本上突破了以前基因研究中只能關(guān)注一個(gè)或幾個(gè)基因的瓶頸，極大地推動(dòng)了相關(guān)研究的進(jìn)展。朱靜等[12]在基因芯片技術(shù)的原理上用數(shù)字基因表達(dá)譜和熒光定量PCR篩選導(dǎo)致雞喙畸形相關(guān)的差異基因。對(duì)200個(gè)雞喙選擇差異表達(dá)基因進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序和熒光定量驗(yàn)證，兩種技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果一致?；潞Ｏ嫉萚13]應(yīng)用DNA芯片研究雞致病性大腸桿菌可能致病基因的表達(dá)。構(gòu)建雞致病性大腸桿菌毒力基因、潛在毒力基因的DNA芯片，成功篩選了雞致病性大腸桿菌在體外不同條件下的毒力基因及可能毒力基因中差異表達(dá)基因。

2.2病毒的基因分型檢測(cè)基因芯片同其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)相比，最大的優(yōu)勢(shì)在于其高通量的特點(diǎn)。大多數(shù)的病毒易產(chǎn)生變異，特別是當(dāng)變異產(chǎn)生一定的臨床意義的時(shí)候，針對(duì)變異區(qū)進(jìn)行序列分析就十分具有意義?；蛐酒夹g(shù)具有高靈敏性、高通量、快速檢測(cè)等特點(diǎn)，為病毒基因分型提供了依據(jù)。楊忠蘋等[14]用克隆禽流感病毒的M基因，H5、H7、H9亞型HA基因，N1、N2亞型NA基因以及看家基因GAPDH的重組質(zhì)粒為模板，用PCR方法擴(kuò)增制備探針，純化后點(diǎn)于氨基修飾的玻片，制備基因芯片。對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果研究表明，該芯片可用于同步鑒別流行的禽流感亞型，是一種有效的新方法；王秀榮等[15]構(gòu)建了檢測(cè)H5、H7、H9亞型禽流感病毒的基因芯片，在病毒RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，用Cy5標(biāo)記樣品cDNA，掃描芯片上探針結(jié)合位點(diǎn)，雜交信號(hào)與預(yù)期設(shè)想基本一致，能夠快速診斷禽流感的各種亞型；Li J.等[16]建立了用以鑒別流感病毒型和亞型的基因芯片檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)的26個(gè)引物對(duì)可從A型流感病毒HA（H1、H2、H3）、NA（N1、N2）和NP基因以及B型流感病毒的HA（H1、H2、H3）、NA（N1、N2）和NP基因上的目的基因雜交，從而達(dá)到鑒別型和亞型的目的。

2.3疾病診斷基因芯片用于疾病診斷有高度的靈敏性、準(zhǔn)確性、快速、同時(shí)檢測(cè)多種疾病等優(yōu)點(diǎn)。陶啟蒙等[17]應(yīng)用不對(duì)稱RT-PCR和基因芯片兩種技術(shù)，構(gòu)建了可同時(shí)區(qū)分AIV的H5、H7、H9血凝素亞型和NI、N2神經(jīng)氨酸酶亞型以及雞傳染性支氣管炎病、新城疫、雞傳染性囊病的基因芯片。樣品檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR、雞胚接種有較高一致性，符合率分別為100%和96%，具有很好的特異性、敏感性。石霖等[18]將蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和銀顯影技術(shù)進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合，建立并優(yōu)化了可同時(shí)鑒別診斷AI、ND、IB、IBD等4種雞病血清抗體的可視化蛋白質(zhì)芯片技術(shù)平臺(tái)。利用該方法檢測(cè)18份臨床樣品，結(jié)果分析可視化蛋白芯片具有很好的特異性，是一種有效的抗體檢測(cè)新方法；Tao Q.等[19]應(yīng)用寡核苷酸基因芯片技術(shù)和不對(duì)稱RT-PCR技術(shù)制備出能同時(shí)區(qū)分AIV的H5、H7、H9血凝素亞型和NI、N2神經(jīng)氨酸酶亞型以及雞傳染性支氣管炎病、新城疫、雞傳染性囊病的基因芯片。他們還對(duì)制備的芯片進(jìn)行了敏感性、特異性和保存期驗(yàn)證，得到了與預(yù)期一致效果，表明該技術(shù)能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)；張偉等[20]以纖維素膜作為生物制作的基質(zhì)，通過(guò)微量點(diǎn)樣制備基因芯片，檢測(cè)新城疫病毒、低致病性禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、減蛋綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體。芯片的靈敏度為RT-PCR和病毒分離的102和104倍，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合率在95%以上；吳時(shí)友等[21]應(yīng)用PCR和RT-PCR方法獲得雞新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎、雞傳染性囊病、雞傳染性喉氣管炎、雞馬立克病、減蛋綜合征、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥、雞腦脊髓炎、雞傳染性貧血、雞病毒性關(guān)節(jié)炎、包涵體肝炎、禽白血病、雞痘的特異性片段，以這些片段為探針，采用接觸式點(diǎn)樣技術(shù)制成低密度的陣列芯片，用該芯片可同時(shí)檢測(cè)出14種雞類傳染病。

3　基因芯片在設(shè)計(jì)中應(yīng)注意的問題

3.1探針引物設(shè)計(jì)基因芯片在制備前首先要按照探針設(shè)計(jì)原則[22]，設(shè)計(jì)特異性高的探針，對(duì)于原核生物設(shè)計(jì)cDNA芯片比較合適，因?yàn)樵宋⑸锏腞NA不帶PolyA的尾巴，難以和rRNA區(qū)分開，因此對(duì)mRNA進(jìn)行特異性的標(biāo)記比較困難，而且原核微生物基因組DNA上所含內(nèi)含子少，易于以基因組DNA序列為模板設(shè)計(jì)PCR引物。而對(duì)于真核生物，對(duì)已知基因序列設(shè)計(jì)長(zhǎng)寡核苷酸探針的芯片比較合適，因?yàn)檎婧松锏幕蚪M比較復(fù)雜，基因家族間的同源性較高，寡核苷酸針具有更好的特異性；真核生物的mRNA含有PolyA的尾巴，容易對(duì)mRNA進(jìn)行特異性的標(biāo)記。

3.2PCR產(chǎn)物純化的方式在制備cDNA芯片時(shí)，首先需要通過(guò)PCR擴(kuò)增靶基因，PCR產(chǎn)物的純化對(duì)結(jié)果影響較大，相關(guān)研究表明[23]PCR產(chǎn)物不需要過(guò)柱純化，因?yàn)檫^(guò)柱純化由于洗脫液中鹽的成分不確定，可能導(dǎo)致PCR產(chǎn)物難以在芯片上進(jìn)行固定，導(dǎo)致DNA點(diǎn)樣的樣點(diǎn)形狀不好。用異丙醇或乙醇沉淀回收的PCR產(chǎn)物足以滿足制備芯片的需求。

3.3芯片點(diǎn)樣時(shí)樣品溶解所用點(diǎn)樣液的選擇

芯片一次取樣往往不超過(guò)0.3 μL，而需要持續(xù)點(diǎn)多個(gè)點(diǎn)，因此在點(diǎn)樣過(guò)程中，需要防止點(diǎn)樣針里的樣品揮發(fā)而導(dǎo)致點(diǎn)樣失敗。所以選擇芯片點(diǎn)樣緩沖液應(yīng)含有核酸穩(wěn)定劑、防水分揮發(fā)劑和黏度增稠劑等成分，能夠增加核酸在芯片上的固定效率，提高DNA芯片上點(diǎn)雜交信號(hào)的強(qiáng)度和均勻性。

3.4不同探針?biāo)没倪x擇長(zhǎng)度20～40 bp的寡核苷酸探針，一般用來(lái)制備檢測(cè)微生物和miRNA的芯片，對(duì)于合成的寡核苷酸探針末端一般要進(jìn)行氨基修飾，可用來(lái)檢測(cè)單個(gè)堿基的不同，提高檢測(cè)的特異性，寡核苷酸探針需要點(diǎn)制在醛基玻片上。長(zhǎng)度在60～70 bp的寡核苷酸探針或PCR產(chǎn)物，一般用來(lái)診斷疾病或檢測(cè)基因的表達(dá)，點(diǎn)制這樣的探針一般使用氨基修飾的基片[24]。

4　存在問題及展望

目前，基因芯片技術(shù)在雞病毒性疾病診斷中的應(yīng)用主要存在以下幾個(gè)方面的問題需要解決[25-27]：首先芯片的制備以及雜交的過(guò)程中都無(wú)法脫離PCR技術(shù)的限制；其次在疾病診斷方面基因芯片技術(shù)還不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量分析；其中最大的問題還是芯片儀器價(jià)格昂貴，限制了它的廣泛使用。但是相信隨著生物科學(xué)、信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，基因技術(shù)將不斷成熟，降低成本，形成產(chǎn)業(yè)化、自動(dòng)化。在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和其他領(lǐng)域中扮演重要的角色。

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通訊作者：文心田，E-mail：xintian3211@126.com

作者簡(jiǎn)介：楊國(guó)淋（1989-），男，碩士生，主要從事動(dòng)物傳染病的研究工作，E-mail：yangguolin1989@163.com

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)項(xiàng)目—?jiǎng)游锒嗖≡咄颗挪榕c診斷技術(shù)應(yīng)用研究（201203056）

收稿日期：2014-09-16

中圖分類號(hào)：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2015）10- 0057- 03