甲病毒載體的研究進(jìn)展

龔文芝，劉 燦，張東東，寧宜寶

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

甲病毒載體的研究進(jìn)展

龔文芝，劉 燦，張東東，寧宜寶?

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

甲病毒屬于披膜病毒科，是一類(lèi)有包膜的單股正鏈RNA病毒。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)甲病毒載體的研究非?；钴S，其已被用于疫苗研究、基因治療以及分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域。基于甲病毒載體的構(gòu)造原理，將其分為三類(lèi)，分別為復(fù)制完全型載體、復(fù)制缺陷型載體和DNA／RNA載體。就這三類(lèi)載體的改造過(guò)程進(jìn)行了探討，并對(duì)這三類(lèi)載體的特點(diǎn)及其應(yīng)用研究進(jìn)展等方面進(jìn)行了闡述，以期為開(kāi)發(fā)出更安全、更有效的甲病毒載體提供參考。

甲病毒；復(fù)制子載體；高水平表達(dá)

甲病毒（Alphavirus）屬于披膜病毒科（Togavirus family），是一類(lèi)有包膜的單股正鏈RNA病毒，該病毒寄主廣泛，由吸血昆蟲(chóng)或節(jié)肢動(dòng)物叮咬易感脊椎動(dòng)物而傳播，目前已發(fā)現(xiàn)包括辛德畢斯病毒（Sindbis virus，SINV）、塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（Venezuelan equine encephalomyelitis virus，VEEV）和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）等30個(gè)成員。甲病毒基因組5’末端的前2／3部分編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，稱為非結(jié)構(gòu)區(qū)，該區(qū)共編碼4種非結(jié)蛋白（nsp1～nsp4），而靠近3’末端的后1／3稱為結(jié)構(gòu)區(qū)，編碼數(shù)種結(jié)構(gòu)蛋白，這些結(jié)構(gòu)蛋白由亞基因組mRNA翻譯得到，其包括衣殼蛋白（C）、膜糖蛋白E1、E2、E3以及6 K蛋白等。甲病毒在感染細(xì)胞過(guò)程中5’末端2／3的基因組RNA首先翻譯，產(chǎn)生RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需要的nsps，然后在nsps的作用下，啟動(dòng)子P26S啟動(dòng)亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄，鑒于亞基因組mRNA的沉降系數(shù)為26S，因此該亞基因組的啟動(dòng)子命名為P26S。隨后經(jīng)過(guò)翻譯，在病毒和宿主編碼蛋白酶的聯(lián)合作用下裂解為衣殼蛋白和膜糖蛋白，這些結(jié)構(gòu)蛋白與病毒基因組RNA裝配成核衣殼后以出芽方式釋放［1］。

基于甲病毒的這些生物特性和復(fù)制特點(diǎn)以及甲病毒cDNA感染性克隆的建立，人們衍生出一些甲病毒表達(dá)載體，目前對(duì)辛德畢斯病毒（SINV）、塞姆利基森林病毒（SFV）、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEEV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）的載體研究最為廣泛。甲病毒載體主要分為三種：復(fù)制型載體、復(fù)制缺陷型載體和DNA／RNA載體，本文將分別對(duì)這三種載體的基本原理和特點(diǎn)以及其應(yīng)用進(jìn)行闡述，旨在為開(kāi)發(fā)出更安全、更有效的甲病毒載體提供參考。

1 甲病毒載體的分類(lèi)

1.1 復(fù)制完全型載體 甲病毒復(fù)制完全型載體系統(tǒng)一般由兩個(gè)載體構(gòu)成：一個(gè)為表達(dá)載體，其包含病毒RNA復(fù)制所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白病毒基因；另一個(gè)為輔助載體，其包含重組病毒顆粒的結(jié)構(gòu)基因，如衣殼、膜蛋白基因和6K蛋白基因等。

這類(lèi)載體本質(zhì)上是重組后的病毒，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后能產(chǎn)生子代病毒顆粒，能夠自我復(fù)制。通過(guò)對(duì)該載體進(jìn)行特異的突變、基因敲除或在病毒序列中適當(dāng)位置引入外源基因，用以研究和闡明甲病毒的生物特性和分子機(jī)理。人們發(fā)現(xiàn)RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）的出錯(cuò)率影響病毒RNA在復(fù)制過(guò)程中的突變率，進(jìn)而影響病毒的感染和傳播能力。Lark L Coffey等［2］在一株CHIKV的感染性克隆基礎(chǔ)之上，將其基因組RdRp所在的nsp4非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的單個(gè)氨基酸C483Y進(jìn)行突變，該突變有利于抵抗病毒突變誘導(dǎo)劑的作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該氨基酸突變的病毒突變體雖然在復(fù)制過(guò)程中確實(shí)保真性有所提高，但是在宿主蚊和新生小鼠體內(nèi)與野生毒株相比感染能力、病毒滴度都有所下降。此外，如何控制復(fù)制完全型載體的復(fù)制與感染及其生物安全是用于疫苗研究亟需解決的關(guān)鍵性問(wèn)題。

1.2 復(fù)制缺陷型載體 甲病毒復(fù)制缺陷型載體系統(tǒng)由兩個(gè)載體構(gòu)成，一個(gè)表達(dá)載體包含病毒RNA復(fù)制所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白病毒基因（nsp1－4）和插在甲病毒強(qiáng)亞基因組26S啟動(dòng)子之后的外源基因；另一個(gè)輔助載體只包含重組病毒顆粒的必需結(jié)構(gòu)基因，如衣殼和膜蛋白基因等。

這類(lèi)載體系統(tǒng)經(jīng)共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞完成包裝之后能形成病毒顆粒，其不能自我復(fù)制但能感染宿主細(xì)胞，具有對(duì)宿主細(xì)胞的廣泛嗜性并進(jìn)行短暫高效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，由于輔助載體缺乏該RNA包裝信號(hào)，在宿主細(xì)胞內(nèi)組裝后的子代病毒不能自我增殖，導(dǎo)致重組的病毒顆粒表現(xiàn)為復(fù)制缺陷的特征，這種復(fù)制缺陷性載體又被稱之為“自殺性載體”。這類(lèi)載體保留了甲病毒的諸多良好的生物特性如廣泛細(xì)胞嗜性、高水平表達(dá)等，表現(xiàn)為復(fù)制缺陷；然而該類(lèi)載體雖然能夠產(chǎn)生較高外源基因的瞬時(shí)表達(dá)且免疫效果良好，但是其成本昂貴，而且在宿主細(xì)胞內(nèi)由表達(dá)載體和輔助載體轉(zhuǎn)錄出的兩種RNA有可能發(fā)生重組從而產(chǎn)生完整的基因組導(dǎo)致病毒的傳播。為了解決這一問(wèn)題，人們采取了多種策略對(duì)這種缺陷型載體進(jìn)行改造，使該類(lèi)載體具備了良好的生物安全性。Berglund等［3］在SFV的p62早期蛋白中E2與E3膜蛋白剪切位點(diǎn)附近進(jìn)行三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，將重組產(chǎn)生復(fù)制型病毒的可能性控制在較低水平。隨后，人們將輔助質(zhì)粒的膜蛋白進(jìn)行突變與單個(gè)輔助質(zhì)粒拆分成多個(gè)輔助質(zhì)粒的策略相結(jié)合，將這種重組可能性降到了極低的水平，理論上的重組概率只有4.2×10－17［4］。Kamrud等［5］發(fā)現(xiàn)通過(guò)缺失啟動(dòng)子P26S的輔助質(zhì)粒不僅不影響缺陷性病毒樣顆粒的產(chǎn)生，而且使重組產(chǎn)生復(fù)制完全型病毒的效率進(jìn)一步降低。

1.3 DNA／RNA載體 DNA／RNA載體是以DNA為基礎(chǔ)的甲病毒載體，這類(lèi)載體攜帶病毒復(fù)制酶基因，將亞基因組啟動(dòng)子P26S之后的病毒結(jié)構(gòu)蛋白由一段多克隆位點(diǎn)代替，并在該多克隆位點(diǎn)插入外源基因，隨后借用甲病毒的復(fù)制酶以及甲病毒亞基因組啟動(dòng)子P26S的高效啟動(dòng)子，大量轉(zhuǎn)錄并翻譯合成外源蛋白。

DNA／RNA載體在轉(zhuǎn)染之前必須首先進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，制備5’末端含有帽子結(jié)構(gòu)和3’末端含有PolyA尾的重組RNA；但是這種方法操作繁瑣，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物容易降解。將真核表達(dá)元件如真核啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)等構(gòu)建入甲病毒重組質(zhì)?？梢杂行Ы鉀Q這一問(wèn)題。Kohno等［6］用人巨細(xì)胞病毒（CMV）早期啟動(dòng)子取代SFV載體原SP6啟動(dòng)子，并引入多聚腺苷酸尾；這種經(jīng)過(guò)改造后的甲病毒載體避免了體外制備RNA繁瑣的過(guò)程，并且以DNA的形式直接轉(zhuǎn)染入動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)。Chen等［7］將質(zhì)粒pSFV1的啟動(dòng)子替換成人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子并且引入SV40poly（A）多聚腺苷酸尾，將改造好的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入沙門(mén)氏菌弱毒株SL7207，而該弱毒株類(lèi)似“運(yùn)載工具”能使質(zhì)粒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明該靶向性的甲病毒復(fù)制子pShT－ePNP能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)外源基因。這類(lèi)載體一般在12 kb左右，筆者將構(gòu)建帶有EGFP熒光蛋白的該類(lèi)載體采用不同公司的轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種試劑轉(zhuǎn)染效率都不高，正是由于較大的相對(duì)分子質(zhì)量使得這類(lèi)載體轉(zhuǎn)染效率不高并且轉(zhuǎn)染方法或試劑也會(huì)帶來(lái)一些負(fù)面效果如間接抑制病毒復(fù)制、激活抗病毒細(xì)胞反應(yīng)等等，由此運(yùn)用新型的轉(zhuǎn)染試劑或方法顯得極為迫切。有研究發(fā)現(xiàn)一些短肽如細(xì)胞透膜肽（Cellpenetrating peptides，CPPs）可以作為有效載體以無(wú)毒副作用的方式來(lái)運(yùn)輸核酸透過(guò)細(xì)胞膜［8－9］。DNA／RNA載體由于不能產(chǎn)生病毒顆粒，喪失了對(duì)宿主細(xì)胞的廣泛嗜性，也還能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞快速凋亡，進(jìn)一步影響外源蛋白的釋放與折疊，從而可能會(huì)影響到免疫效果。

2 甲病毒載體的特點(diǎn)

2.1 高水平表達(dá) 甲病毒載體產(chǎn)生的重組RNA復(fù)制子在其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)之后能高水平復(fù)制，如基于SFV復(fù)制缺陷型載體產(chǎn)生的重組RNA在每個(gè)細(xì)胞內(nèi)大概有2×105個(gè)拷貝。甲病毒載體對(duì)外源基因的表達(dá)性能比非復(fù)制子載體要高。任曉慧等［10］將表達(dá)生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH）的復(fù)制子載體pCMV－Rep－GHRH、普通載體 pIRES－GHRH和pCDNA3－GHRH轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，將這三種不同載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用放射性免疫法（Radioimmunoassay，RIA）和RT－PCR對(duì)表達(dá)的GHRH進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明復(fù)制子載體表達(dá)外源基因的效率比非復(fù)制子載體高2～3倍。

2.2 增強(qiáng)免疫原性 甲病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞之后，在細(xì)胞質(zhì)中能夠大量合成出正、負(fù)鏈RNA，從而形成大量的雙鏈RNA復(fù)制中間體，其能夠激活非p53依賴性的雙鏈RNA依賴的蛋白激酶PKR和活化RnaseL導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的凋亡小體能夠被表面具有ανβ5受體的樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）以及其他一些抗原呈遞細(xì)胞的攝取，提呈給CD8＋T細(xì)胞，可激發(fā)強(qiáng)而有力的細(xì)胞免疫［11］。甲病毒載體可誘導(dǎo)產(chǎn)生I型IFN，從而為表達(dá)抗原起到提供佐劑的效果。Leither等［12］用SIN DNA載體與普通載體分別在正常與敲除IFN－α／β受體的小鼠體內(nèi)表達(dá)黑色素瘤抗原，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該載體與普通載體在敲除IFN－α／β受體的小鼠體內(nèi)都不能產(chǎn)生激活I(lǐng)FN－α／β途徑的反應(yīng)，而在正常小鼠體內(nèi)，SIN載體能產(chǎn)生比普通載體更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。Andrei Nikonov等［13］發(fā)現(xiàn)甲病毒的病毒復(fù)制酶只有在具有完整的RdRp活性時(shí)才能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN－β，在甲病毒感染宿主細(xì)胞后，其病毒復(fù)制酶可以對(duì)病毒RNAs和細(xì)胞RNAs進(jìn)行修飾，激活RNA解旋酶RIG－1和MDA5等分子，從而介導(dǎo)I型IFN基因的轉(zhuǎn)錄。

3 甲病毒載體在疾病防治和生物制藥方面的應(yīng)用

3.1 疫苗研究 復(fù)制完全型載體會(huì)引起生物安全方面的問(wèn)題，由于插入外源基因?qū)е缕浠蚪M大于野生型基因組從而容易呈現(xiàn)不穩(wěn)定性，因此目前其主要用于甲病毒分機(jī)子機(jī)理方面的研究。復(fù)制缺陷型甲病毒載體，尤其是塞姆利基病毒和辛德畢斯病毒缺陷型以及近幾年來(lái)出現(xiàn)的VEEV－SINV嵌合體，正變成快速和高水平的基因表達(dá)的工具。甲病毒復(fù)制缺陷型表達(dá)系統(tǒng)也已經(jīng)被用來(lái)作為治療與預(yù)防包括 HIV、Hendra和 Nipah許多病毒性疾?。?4－15］。Vander Veen等［16］將豬流感病毒血凝素HA基因構(gòu)建入復(fù)制缺陷型VEEV載體系統(tǒng)中，分別免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠和豬，實(shí)驗(yàn)證明高劑量的該疫苗免疫動(dòng)物之后不但沒(méi)有引起VEEV的散播，而且免疫之后沒(méi)有出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象，在免疫宿主豬時(shí)能夠產(chǎn)生很強(qiáng)的體液反應(yīng)、IFN－γ免疫反應(yīng)和能夠抵抗同源豬流感強(qiáng)毒的攻擊。也有研究者將VEEV空殼粒子作為滅活流感病毒疫苗的佐劑分子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該空殼粒子能夠明顯提高滅活疫苗的免疫保護(hù)作用［17］。DNA／RNA載體在疫苗應(yīng)用方面也很廣泛。Cheng等［18］將兔出血熱病病毒的VP60基因構(gòu)建入，通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)VP60基因得到表達(dá)，免疫兔實(shí)驗(yàn)表明該復(fù)制子疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗體和介導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且對(duì)致死毒量的攻擊達(dá)到全保護(hù)。筆者將佐劑蛋白GP96N端（26AA－374AA）基因與豬瘟病毒囊膜蛋白E2基因用linker串聯(lián)之后構(gòu)建入塞姆利基森林病毒復(fù)制子pSCA1中，探討佐劑分子能否進(jìn)一步提高免疫效果，目前對(duì)該構(gòu)建完成的質(zhì)粒進(jìn)行免疫原性的研究中。Sun等［19］將SFV復(fù)制子元件和豬瘟病毒囊膜蛋白E2基因構(gòu)建入腺病毒骨架內(nèi)構(gòu)成新的嵌合載體疫苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該疫苗解決了單純采用甲病毒復(fù)制子疫苗和腺病毒疫苗免疫保護(hù)不完全的問(wèn)題，具備良好的免疫原性，同時(shí)為新的疫苗設(shè)計(jì)提供了思路。

3.2 癌癥研究 甲病毒載體在抗癌癥研究中具有重大的潛力。甲病毒載體可以用來(lái)表達(dá)腫瘤抗原或者抗腫瘤蛋白，能殺死癌癥細(xì)胞，而且甲病毒載體也能增強(qiáng)抗原表達(dá)和激發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制［26］。采用甲病毒載體表達(dá)一些細(xì)胞因子如IL－12、IL－18、GM－CSF或者腫瘤相關(guān)抗原（Tumor associated antigens，TAAs）來(lái)作為疫苗已經(jīng)成功運(yùn)用到腫瘤動(dòng)物模型；而且SINV具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的自然嗜性，能夠?qū)Ｐ哉T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［20－23］。 Tseng等［24］將自殺式基因hsvtk構(gòu)建入SINV復(fù)制完全型載體的nsp3中，結(jié)果表明在前藥苷昔洛韋的存在下，該載體能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其一方面抑制辛德畢斯病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖，另一方面有助于前藥激活之后產(chǎn)生的毒力代謝產(chǎn)物擴(kuò)散到周?chē)锤腥镜哪[瘤細(xì)胞，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。此外，基于VEEV的復(fù)制缺陷型載體疫苗治療前列腺癌已進(jìn)入I期臨床實(shí)驗(yàn)［25］。

3.3 外源蛋白表達(dá) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞源的醫(yī)用和獸用生物藥品的數(shù)量與日俱增，而在生物制藥方面，人們普遍認(rèn)為生產(chǎn)外源蛋白有兩種策略：采用穩(wěn)定的細(xì)胞系和基因的短暫表達(dá)。市場(chǎng)上的這類(lèi)生物藥品全部來(lái)自與穩(wěn)定的重組細(xì)胞系，由于瞬時(shí)基因表達(dá)過(guò)程能夠在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生高水平的蛋白表達(dá)而成為研究的熱點(diǎn)，而且病毒性的載體已經(jīng)被大量運(yùn)用于表達(dá)重組蛋白，其中復(fù)制缺陷型的塞姆利基病毒載體和辛德畢斯病毒載體由于良好的生物安全性、細(xì)胞的廣泛嗜性和快速高水平的基因表達(dá)能力受到廣泛青睞。許多不同的重組蛋白也已經(jīng)在甲病毒載體中得到表達(dá)，這些重組蛋白包括功能性的膜蛋白、受體、酶以及病毒蛋白。修飾后的SFV載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體，能夠達(dá)到10 mg／L和100～300 pmol／mg的總蛋白，相比穩(wěn)定的細(xì)胞系和其他瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載體，采用塞姆利基病毒載體表達(dá)的產(chǎn)量是穩(wěn)定的細(xì)胞系和其他瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載體的20多倍［26－27］。然而，這些表達(dá)的蛋白也還僅限于實(shí)驗(yàn)水平，需要進(jìn)一步優(yōu)化條件才能進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，如降低病毒生產(chǎn)的費(fèi)用，合適的生物反應(yīng)器和感染病毒粒子之后的培育措施以及病毒粒子的定量方法等［28］。

4 展望

三類(lèi)甲病毒載體都具有區(qū)別其他病毒或非病毒性載體的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而且也各具千秋。目前，甲病毒載體已經(jīng)在甲病毒分子機(jī)理、抗癌癥研究和治療許多病毒性疾病方面得到了廣泛的應(yīng)用，但是其潛力還沒(méi)有得到充分的挖掘。開(kāi)發(fā)可控型、具有靶向治療效果的甲病毒載體和建立能夠提高該類(lèi)載體瞬時(shí)外源蛋白表達(dá)量的細(xì)胞系以及探究該類(lèi)載體的臨床實(shí)驗(yàn)效果等都是今后努力的方向。相信隨著對(duì)甲病毒載體研究的不斷深入，該類(lèi)載體在有效性和安全性方面將進(jìn)一步提高，從而為未來(lái)對(duì)抗疾病提供有力的生物學(xué)工具。

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（編 輯：李文平）

Review on Alphavirus－based Vectors

GONG Wen－zhi，LIU Can，ZHANG Dong－dong，NING Yi－bao?
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing100081，China）

Alphaviruses belong to the family ofTogaviridae，which are encapsulated by a capsid protein and possess single strand plus RNA.In recent years，the domestic and foreign research on alphavirus－based vectors is active and the alphavirus－based vectors have been used for vaccine research，gene therapy and molecular biology research.Based on the structural principle，the alphavirus vectors are classified into three main types：replicationcompetent vector，replication－deficient vectors and DNA－layered vector.In this review，the transformation，characteristics and application of three different alphavirus－based vectors are discussed in order to provide references for the development of safer，more effective alphavirus－based vectors.

alphaviruses；replicon－based vectors；high－level expression

2014－12－03

A

1002－1280（2015）04－0065－05

S852.65＋9.6

龔文芝，碩士研究生，從事獸用疫苗研發(fā)工作。

寧宜寶。E－mail：ningyibao＠ivdc.org.cn