肺移植慢性排異反應(yīng)動(dòng)物模型研究進(jìn)展

周文勇，周曉慧，范慧敏，*

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院胸心外科，上海　200120；2.同濟(jì)大學(xué)東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上?！?00120)

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肺移植慢性排異反應(yīng)動(dòng)物模型研究進(jìn)展

周文勇1，周曉慧2，范慧敏1，2*

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院胸心外科，上海200120；2.同濟(jì)大學(xué)東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海200120)

【摘要】慢性排異反應(yīng)是導(dǎo)致肺移植后期移植失敗的主要原因。閉塞性細(xì)支氣管炎(obliterative bronchiolitis, OB) 是肺移植后慢性排異反應(yīng)的最主要病理學(xué)特征改變。而動(dòng)物模型在肺移植慢性排異反應(yīng)研究過程中，起到了不可或缺的作用。到目前為止，已經(jīng)有多種動(dòng)物模型被建立并用來模擬人類肺移植后中、遠(yuǎn)期慢性排異反應(yīng)。但這些動(dòng)物移植模型都或多或少存在缺陷。近年來，小鼠原位肺移植模型為研究OB提供了潛在可能。本文通過回顧各類肺相關(guān)移植模型的建立，對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析比較，探討今后肺移植慢性排異疾病模型建立的可能途徑。

【關(guān)鍵詞】肺移植；慢性排異；閉塞性細(xì)支氣管炎；動(dòng)物模型

肺移植是除腫瘤外大多數(shù)終末期肺部疾病唯一有效的治療手段。慢性排異反應(yīng)是導(dǎo)致肺移植后病人遠(yuǎn)期死亡的重要原因之一。慢性排異反應(yīng)表現(xiàn)為細(xì)支氣管閉塞綜合征(bronchiolitis obliterans syndrome, BOS)，其主要病理表現(xiàn)為閉塞性細(xì)支氣管炎(obliterative bronchiolitis, OB)—一種由于淋巴細(xì)胞浸潤在支氣管壁內(nèi)及周圍所導(dǎo)致慢性纖維性病變。約有68%病人在肺移植術(shù)后3個(gè)月伴有不同程度的OB[1]。因此，通過多種途徑對(duì)肺移植后OB進(jìn)行轉(zhuǎn)化性研究，對(duì)提高肺移植病人遠(yuǎn)期生存率有著重要的意義。而穩(wěn)定有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型則是研究進(jìn)行的必要條件。

在長期的探索過程中，研究者建立了一系列實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型用于模擬人類肺移植后慢性排異病理狀態(tài)。這些動(dòng)物模型按照所使用動(dòng)物類型可分為大型哺乳動(dòng)物模型和小型哺乳動(dòng)物模型；按照建立方法可分為移植模型和非移植模型；按照移植物植入部位可分為異位移植模型和原位移植模型。本文主要通過在移植模型分類框架下結(jié)合其他分類方法回顧討論各類肺移植相關(guān)模型的優(yōu)點(diǎn)與劣勢(shì)。此外，小鼠原位肺移植模型是近年來出現(xiàn)一種新的肺移植動(dòng)物模型，本文還將探討該動(dòng)物模型的發(fā)展現(xiàn)狀以及充當(dāng)肺移植慢性排異反應(yīng)模型所面臨的問題。

1異位氣管移植

1.1小鼠

小鼠異位氣管移植出現(xiàn)于1993年[2]。通過手術(shù)將部分供體小鼠氣管植入到受體皮下。至術(shù)后10 d 同種異系氣管移植物出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)上皮細(xì)胞損傷以及纖維增生性改變；至術(shù)后3周可觀察到由纖維和肉芽組織增生所導(dǎo)致的管腔狹窄。使用同種同系氣管作為供體進(jìn)行異位移植則不會(huì)出現(xiàn)上述情況，移植物在術(shù)后相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)保持正常組織形態(tài)。

基于這一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究者采用包括環(huán)孢素(cyclosporine，CsA)[3]，雷帕霉素(rapamycin)[4], FTY720聯(lián)合細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)[5]，以及最新出現(xiàn)的抗纖維化藥物Pirfenidone[6]和免疫抑制劑PX3.102，雷公藤多甙等[7，8]各種方法試圖對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到特定的研究要求。小鼠異位氣管移植模型的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在易于操作和良好的重復(fù)性，能夠較好的反映人類肺移植OB發(fā)生后氣道上皮損傷，氣管壁炎癥以及纖維化反應(yīng)。然而，受體所植入的氣管移植物源于供體大氣道，而人類肺移植后移植物發(fā)生OB主要累及小氣道。另外，異位氣管移植物植入受體后無法實(shí)現(xiàn)血供以及跟外界的氣體交換。這些因素均導(dǎo)致小鼠異位氣管移植模型無法最佳的模擬人類真實(shí)肺移植后狀態(tài)。此外，異位氣管移植后無法對(duì)移植物進(jìn)行實(shí)時(shí)功能檢測或獲得支氣管灌洗液。

1.2大鼠

采用大鼠進(jìn)行異位氣管移植也可將供體氣管植入到受體網(wǎng)膜內(nèi)。Boehler等[9]通過這一模型，將觀察到的同種異系氣管移植物OB病理過程描述為三個(gè)階段：缺血壞死期，移植物表現(xiàn)為上皮細(xì)胞脫落和局部缺血壞死；淋巴細(xì)胞浸潤期，表現(xiàn)為氣管周圍和管腔內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤；纖維閉塞期，主要表現(xiàn)為纖維和肉芽組織代替氣管粘液層出現(xiàn)管腔狹窄。

動(dòng)物的大小決定了大鼠異位氣管移植模型在操作上要比小鼠異位氣管移植簡單。但采用大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也面臨實(shí)驗(yàn)試劑，轉(zhuǎn)基因/基因敲除動(dòng)物匱乏等因素的限制。其他限制該模型應(yīng)用的因素與小鼠異位氣管移植模型類似。

Dutly等[10]在原有大鼠異位氣管移植模型基礎(chǔ)上，通過將供體氣管植入到受體肺中完成模型建立。采用這種方法，至移植術(shù)后第21天能夠觀察到同種異系氣管移植物出現(xiàn)上皮細(xì)胞和基底膜的破壞以及管腔狹窄，而對(duì)比同種同系移植物則未發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。國內(nèi)張瑜等[11]發(fā)現(xiàn)氣管上皮細(xì)胞在閉塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)展中起到重要作用。

1.3犬類

Nakanishi和國內(nèi)閆小龍等報(bào)道了將供體氣管植入到受體網(wǎng)膜內(nèi)用以建立犬類異位氣管移植模型的方法[12,13]。至術(shù)后10 d，同種異系氣管移植物未表現(xiàn)出上皮細(xì)胞再生；至術(shù)后28 d，移植物表現(xiàn)出纖維和肉芽組織增生。到目前為止，該類異位氣管移植模型已基本被嚙齒類動(dòng)物異位氣管移植模型所代替。

2異位支氣管、肺移植

2.1小鼠

小鼠異位支氣管、肺移植最初由兩個(gè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行了研究。Hertz等[2]同時(shí)報(bào)道了小鼠異位支氣管移植模型和異位肺移植模型。Xavier-Elsas等[14]，也對(duì)小鼠異位肺移植模型進(jìn)行了報(bào)道。這類模型雖然提供了研究肺內(nèi)小氣道病理改變的可能。但是，異系供體肺在植入受體后短期內(nèi)迅速發(fā)生實(shí)變壞死，從而不能觀察到移植物后期的慢性病理變化。這一缺陷限制了小鼠異位支氣管、肺移植模型的廣泛應(yīng)用。而國內(nèi)則較少采用類似方法建立移植模型。

2.2靈長類

Hausen等[15]在對(duì)靈長類動(dòng)物進(jìn)行原位肺移植的同時(shí)，將支氣管異位移植到受體皮下，觀察兩種移植物的排異反應(yīng)。結(jié)果顯示支氣管異位移植物表現(xiàn)出管腔上皮細(xì)胞脫落缺失，呈現(xiàn)中度到重度的急性排異反應(yīng)。盡管該實(shí)驗(yàn)不是為研究慢性排異反應(yīng)而設(shè)計(jì)，但在一定程度上為今后開展大型動(dòng)物慢性排異反應(yīng)研究提供了可能。運(yùn)用靈長類動(dòng)物作為器官供體和受體，受到動(dòng)物來源，經(jīng)濟(jì)及倫理學(xué)等因素的制約，限制了該動(dòng)物模型的進(jìn)一步發(fā)展。

2.3豬

豬異位支氣管移植模型用以研究慢性排異反應(yīng)最早報(bào)道于1998年[16,17]。包括或不包括肺組織的終末細(xì)支氣管移植于受體豬的皮下組織。同種異系移植物在移植后出現(xiàn)上皮細(xì)胞受損缺失，支氣管管腔狹窄，管壁纖維化以及單核細(xì)胞浸潤堆積。而同種同系移植物至術(shù)后6個(gè)月僅表現(xiàn)為輕度的上皮細(xì)胞受損。采用環(huán)孢素，糖皮質(zhì)激素，硫唑嘌呤等免疫抑制劑能夠抑制異位支氣管移植物中的炎癥反應(yīng)，減緩支氣管軟骨受損和管腔狹窄程度，但不能有效延緩上皮組織受損[17-19]。隨后一系列針對(duì)肺移植后急慢性排異反應(yīng)的研究都曾使用過該動(dòng)物模型[20-27]。豬異位支氣管移植模型的優(yōu)點(diǎn)在于它較原位肺移植簡單，能夠多位點(diǎn)將移植物植入受體體內(nèi)，在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)獲取移植物。使用免疫抑制劑的情況下，在3～4周能夠觀察到小氣道阻塞，從而為研究慢性排異反應(yīng)提供可能。國內(nèi)目前尚未有基于該模型的研究報(bào)道。該模型的主要缺點(diǎn)在于缺乏多樣化的實(shí)驗(yàn)試劑，并且無法對(duì)移植物進(jìn)行功能學(xué)檢測。

3原位氣管移植

原位氣管移植模型是目前應(yīng)用最為廣泛的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型。廣泛應(yīng)用于損傷修復(fù)，缺血-再灌注損傷，供體保存等各領(lǐng)域研究[28-30]。

3.1小鼠

較為詳細(xì)的小鼠原位氣管移植后排異反應(yīng)過程描述最初見于2002年。同種異系原位氣管移植后受體小鼠在術(shù)后短期出現(xiàn)喘鳴，隨后移植物出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，管壁水腫，表面粘液層丟失等現(xiàn)象[31]。

小鼠原位氣管移植模型會(huì)出現(xiàn)移植物再上皮化現(xiàn)象，這一現(xiàn)象主要表現(xiàn)為異系氣管移植物最初移植到受體后經(jīng)歷短期的急性排異反應(yīng)，管腔表面所覆蓋的上皮細(xì)胞遭到破壞而缺失。待度過急性期后受體源性上皮細(xì)胞會(huì)重新覆蓋生長于氣管移植物腔內(nèi)表面。這種現(xiàn)象有利于緩解排異反應(yīng)對(duì)移植物造成的損傷[32-37]。值得注意的是，原位氣管移植物結(jié)局有別于異位氣管移植物，在原位氣管移植中，同種異系移植物由于受到受體源性的再上皮化，因此不會(huì)形成明顯的管腔纖維化[32,33]，很難觀察到典型的OB改變。該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型最大的優(yōu)點(diǎn)在于氣管移植物與外界相通，一定程度上模擬了移植后狀態(tài)。但是，它同樣無法實(shí)現(xiàn)移植物與受體血管的大面積再通。

3.2大鼠

使用大鼠進(jìn)行原位氣管移植要早于小鼠原位氣管移植[38]。在大鼠原位氣管移植模型中同樣存在有移植氣管再上皮化的現(xiàn)象[38-41]。這一模型的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)與小鼠原位氣管移植模型基本相同。

4原位肺移植

4.1小鼠

2007年Okazaki等[42]最早報(bào)道了基于小鼠的原位肺移植模型。該技術(shù)依靠套管技術(shù)用以吻合供體肺與受體肺的支氣管，肺動(dòng)脈與肺靜脈。由于小鼠左肺僅有一葉，所以目前所進(jìn)行的小鼠原位肺移植均對(duì)左肺進(jìn)行。對(duì)于這種模型，同種同系肺移植物從術(shù)后7～28 d，無論肉眼大體標(biāo)本或是鏡下與右側(cè)原位肺對(duì)比，均無明顯改變。而同種異系移植物在術(shù)后早期即出現(xiàn)充血水腫，肺血管旁單核細(xì)胞以及支氣管上皮細(xì)胞下淋巴細(xì)胞浸潤。至術(shù)后2周左右即會(huì)出現(xiàn)移植物肺泡內(nèi)出血，肺小動(dòng)脈血栓形成，支氣管腔內(nèi)大量淋巴細(xì)胞聚集阻塞，甚至壞死。Jungraithmayr等[43]也通過描述小鼠原位肺移植操作過程，驗(yàn)證了這一方法的有效性和可重復(fù)性。相較異位氣管移植而言[44]，盡管存在嚴(yán)重的血管排異反應(yīng)，原位肺移植模型移植物并不會(huì)出現(xiàn)氣管上皮細(xì)胞缺失[45]。

小鼠原位肺移植無疑顯示了巨大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，它能夠最接近真實(shí)的模擬人類肺移植后狀態(tài)。不同于原位或異位氣管移植，原位肺移植物在受體中表現(xiàn)為通氣和血流灌注狀態(tài)，因而短期內(nèi)能夠承擔(dān)一部分受體的生理學(xué)功能。借助小動(dòng)物CT (Micro-CT)，在不處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的條件下，實(shí)時(shí)評(píng)估移植物影像學(xué)表現(xiàn)，可以動(dòng)態(tài)反映移植物的病理改變過程。此外，通過肺功能，支氣管肺泡灌洗液檢測，也能夠在移植后不同階段移植物的評(píng)估中發(fā)揮作用[46]。豐富的生物學(xué)資源如，試劑、抗體、基因敲除動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等也為今后小鼠原位肺移植模型的廣泛應(yīng)用提供了可能。目前，這一模型主要用于急性排異反應(yīng)的研究。有學(xué)者基于主要組織相容復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)輕微不匹配(MHC-mini mismatch)的原理將C57/B10小鼠作為供體肺來源，移植于C57/B6小鼠體內(nèi)。較之前多采用BALB/c小鼠作為供體，這一新的策略希望通過弱化移植后早期急性排異反應(yīng)所導(dǎo)致的移植物損傷，使其能夠過渡到慢性排異反應(yīng)階段。結(jié)果顯示約50% 的移植物出現(xiàn)了OB改變。此外，也有學(xué)者在小鼠異系原位肺移植后早期采用免疫抑制劑干預(yù)的策略，減緩急性排異強(qiáng)度從而誘導(dǎo)OB發(fā)生。上述方法為基于小鼠原位肺移植模型用于OB的研究提供了潛在可能。但是其有效性和可重復(fù)性值得今后進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4.2大鼠

大鼠原位肺移植模型最早建立于70年代初期[47]。手術(shù)中器官吻合經(jīng)歷了從絲線吻合到套管吻合的過程[48,49]，近期也有報(bào)道采用連續(xù)縫合作為吻合的主要方式[50]。大鼠原位肺移植模型廣泛應(yīng)用于急性排異反應(yīng)和免疫耐受等方面的研究[51-68]。在大鼠異系肺移植術(shù)后給予環(huán)孢素干預(yù)，6個(gè)月后移植肺中小氣道上皮基本正常，僅有輕度的淋巴細(xì)胞浸潤。大氣道表現(xiàn)為內(nèi)膜潰瘍和黏膜下淋巴細(xì)胞浸潤，部分管腔內(nèi)可觀察到纖維性增生[69]。Hirt等[70]研究發(fā)現(xiàn)在異系移植后急性排異反應(yīng)早期給予糖皮質(zhì)激素，可使移植物在術(shù)后100 d左右均保持基本正常形態(tài)。而推遲使用糖皮質(zhì)激素，則會(huì)造成移植物在術(shù)后60～100內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的慢性排異反應(yīng)。Yasufuku等[71]報(bào)道，在肺移植前給予受體大鼠V型膠原會(huì)加重移植后急性排異反應(yīng)。Zhang等[50]發(fā)現(xiàn)，在移植術(shù)后給予每日環(huán)孢素和麥考酚嗎乙酯(mycophenolate mofetil)，能夠誘導(dǎo)部分異系肺移植大鼠移植肺中出現(xiàn)OB病理改變。Jungraithmayr等[72]在移植后早期聯(lián)合應(yīng)用環(huán)孢素和雷帕霉素，結(jié)果顯示至術(shù)后84 d，80%的移植肺氣管雖未出現(xiàn)到明顯的阻塞樣病理改變，但都存在有不同程度的纖維性改變。相對(duì)于小鼠原位肺移植模型，大鼠原位肺移植模型在研究中缺乏豐富的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)試劑，這也在一定程度上制約了該模型的廣泛應(yīng)用。

5結(jié)論

通過回溯之前的研究，我們發(fā)現(xiàn)理想的肺移植慢性排異反應(yīng)動(dòng)物模型應(yīng)當(dāng)具備：(1)有典型的病理學(xué)表現(xiàn)；(2)能夠應(yīng)用現(xiàn)有的技術(shù)手段進(jìn)行檢測；(3)與人類肺移植后病理，生理狀態(tài)相接近；(4)有豐富的下游研究資源；(5)受其他非研究因素，如經(jīng)濟(jì)和倫理學(xué)等因素干預(yù)小。在此背景下小鼠原位肺移植模型則成為重要的備選方案之一。

除外其建立過程中需要復(fù)雜的手術(shù)操作，小鼠原位肺移植模型目前尚無統(tǒng)一方法誘導(dǎo)其發(fā)生慢性排異反應(yīng)。在無外界干預(yù)的狀態(tài)下，選擇同種同系供體肺移植到受體后，在相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)將不會(huì)出現(xiàn)任何移植排異反應(yīng)，而選擇異系供體肺移植到受體后，往往由于所誘發(fā)的急性排異反應(yīng)強(qiáng)度過于劇烈，短期內(nèi)迅速導(dǎo)致移植物壞死，從而無法出現(xiàn)慢性排異反應(yīng)。采用降低供受體間MHC不匹配性和應(yīng)用免疫抑制劑的方法能減緩急性排異反應(yīng)，有可能使移植物有機(jī)會(huì)度過急性排異期，從而逐步出現(xiàn)慢性排異表現(xiàn)。這一研究策略也成為解決這一問題的潛在途徑。

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綜述·進(jìn)展

Advances in research on animal models of chronic rejection

after lung transplantation

ZHOU Wen-yong1, ZHOU Xiao-hui2, FAN Hui-min1, 2

(1. Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery, 2. Research Center for Translational Medicine,

Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200120, China)

【Abstract】The most important cause of late mortality after lung transplantation is obliterative bronchiolitis (OB). It is clear that a good animal model is indispensable to further unravel and clarify the pathogenesis of bronchiolitis obliterans syndrome (BOS). Many animal models have been developed to study BOS, however, so far, none of these models truly mimics the human condition. In recent years mouse models of orthotopic lung transplantation have been established, which provide potential possibilities for further studies of OB/BOS after lung transplantation. The aim of this article was to review the pros and cons of those animal models, and discuss the possible approaches to establish animal models of chronic rejection after lung transplantation.

【Key words】Lung transplantation; Chronic rejection; Obliterative bronchiolitis, OB; Bronchiolitis obliterans syndrome, BOS; Animal models

[收稿日期]2015-01-17

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.018

【中圖分類號(hào)】Q95-33，R617

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847(2015) 02-0199-06

[通訊作者]范慧敏，男，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：移植免疫。E-mail: frankfan@#edu.cn；周曉慧，女，副研究員，研究方向：免疫調(diào)節(jié)。E-mail: xhzhou100@hotmail.com

[作者簡介]周文勇，男，主治醫(yī)師，博士，研究方向：肺移植免疫。E-mail： 123zwy@#edu.cn

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81273263; 81202332)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì) (11JC1410800, 801)；上海市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)專科建設(shè)(ZK2012A27)；上海領(lǐng)軍人才(2012053)；浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)領(lǐng)先人才培養(yǎng)(PWR12011-01)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)學(xué)科群(Grant No. PWZxq2014-01)。