載脂蛋白E基因型在老年人群中的分布及與老年認(rèn)知損傷的關(guān)系

殷淑琴 聶宏偉 徐 勇(湖州師范學(xué)院，浙江 湖州 33000)

老年癡呆已經(jīng)成為危及老年健康和社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大公共衛(wèi)生問題。認(rèn)知功能損傷作為發(fā)展為老年癡呆的過渡階段得到了人們的關(guān)注，研究影響認(rèn)知功能損傷發(fā)生的相關(guān)因素也成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題〔1～4〕。本次研究針對國內(nèi)外研究存在很大爭議的基因進(jìn)行分析，旨在為早期預(yù)防高危人群提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 在蘇州和湖州市農(nóng)村的5個(gè)社區(qū)，選取546例老年人作為研究對象，男247例，女 299例，平均年齡(67.25±9.87)歲。由經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)的3名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師采用蒙特利爾認(rèn)知功能量表(MOCA)〔5〕對老年人進(jìn)行認(rèn)知能力測評。量表評估項(xiàng)目主要包括注意與集中、執(zhí)行功能、記憶、語言、視結(jié)構(gòu)技能、抽象思維、計(jì)算和定向力等8個(gè)領(lǐng)域，量表總分30分，其中≥26分為正常，＜26分為輕度認(rèn)知功能損害〔6〕。

1.2載脂蛋白(Apo)E基因型檢測方法〔7〕取血細(xì)胞，溶入生理鹽水2 ml，采用DNA提取試劑盒，按說明提取DNA，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測DNA純度，再用Eppendorf核酸定量儀測定 DNA 濃度(260 nm 吸光率＞0.05，DNA 含量＞2.0 μg/μl，吸光率A260/A280比值為1.6～1.8，320 nm波長處吸光率接近0)。PCR擴(kuò)增:根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)相關(guān)文獻(xiàn)提供的研究結(jié)果，確定候選目的基因片段，利用GenBank上提供的序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系(總體系20 μl)采用10×PCR Buffer(含15 mmol/L MgCl2)2 μl，Hot-Star Taq DNA Polymerase(QIAGEN 公司)0.2 μl，5×Q-Solution 4 μl，dNTPmix(每 種 10 mmol/L)2 μl，Primer1 1 μl，Primer2 1 μl，模板 DNA 1 μl，蒸餾水 8.8 μl。將測序樣本置 ABI-2700型擴(kuò)增儀中95℃ 預(yù)變性15 min，用Touchdown-PCR，94℃變性50 s，63℃ ～58℃退火 1 min(－0.5℃ /1 min)，72℃延伸 1 min，共循環(huán)10次，94℃變性50 s，57℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共循環(huán)30次，最后于72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一目的條帶，根據(jù)V-GENE公司提供的PCR純化試劑盒，對PCR產(chǎn)物過柱純化后，進(jìn)行測序反應(yīng):反應(yīng)體系 1 μl BigDye(2.5 倍)+1.5 μl BigDye Seq Buffer(5 倍)+3 μl引物+1 μl PCR 純化產(chǎn)物+3.5 μl雙蒸水。測序熱循環(huán)條件:96℃，10 s→(96℃10 s→50℃5 s→60℃4 min)×25個(gè)循環(huán)→60℃，4 min→4℃保溫。測序反應(yīng)后純化:每管加入125 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)1 μl到管底，再加入3 mol/L醋酸鈉(NaAc)1 μl→每管加入 100% 酒精 25 μl，鋁箔封嚴(yán)密，震蕩混勻4次，室溫放置15 min→1 600 r/min，離心45 min，馬上倒置于96孔ABI板，離心至185 r/min，停止離心→每管加入 75% 酒精35 μl，1 650 r/min，4℃ 離心 15 min(JOUANBR4i);立即倒入96孔板，離心至185 r/min停止離心→重復(fù)第4步驟1次→室溫?fù)]發(fā)凈酒精，加入10 μl Hi-DiFormamide溶解DNA→樣品在95℃變性4 min，迅速置冰中冷卻4 min?；驕y序:電泳前，在數(shù)據(jù)采集(DataCollection 2.0)軟件中選擇正確的運(yùn)行模塊和分析模塊。上樣至3100-Avant遺傳分析儀進(jìn)行電泳。應(yīng)用Data Collection軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。結(jié)果分析:將測序結(jié)果用DNA Sequencing Analysis 5.1自動(dòng)分析原始測序數(shù)據(jù)，獲得測序電泳圖和序列。將樣品序列用DNA Star Seqman與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，觀察樣本基因序列的多態(tài)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1老年人群ApoE基因型分布情況分析 ApoE基因型分布中E3/3純合子頻率最高，占 72.89%，E2/2型最少，僅占1.28%，其余E3/4型占11.90%、E2/3型占8.61%、E4/4型占3.3%、E2/4占2.01%。

2.2老年認(rèn)知損傷與ApoE基因型的關(guān)系 根據(jù)MoCA檢測結(jié)果，546例老年人中有189例老年人為認(rèn)知損害。以189例老年認(rèn)知損害作為病例組，以其余357例為對照組，比較兩組ApoE基因型頻數(shù)分布情況，結(jié)果表明，認(rèn)知損傷的老人中攜帶ApoE E4等位基因率明顯高于對照組〔32.3%(61/189)vs 9.2%(33/357)，χ2=46.658，P＜0.001〕，病例組 E2(3/189)、E3(125/189)與對照組E2(4/357)、E3(320/357)比例無顯著差異(P＞0.05)。

3討論

認(rèn)知功能損傷人群癡呆的轉(zhuǎn)化率為正常人群的10倍，給社會和家庭帶來的沉重的負(fù)擔(dān)〔8〕。預(yù)防及控制老年癡呆的發(fā)生成為臨床醫(yī)生和公共衛(wèi)生專家關(guān)注的重點(diǎn)。針對可能預(yù)防的因素進(jìn)行重點(diǎn)預(yù)防，對認(rèn)知功能損害的高危人群進(jìn)行重點(diǎn)干預(yù)是改善老年人健康的重要策略。國內(nèi)外研究認(rèn)為影響認(rèn)知功能損傷的因素很多，包括生活習(xí)慣等因素:高血壓、高脂血癥、糖尿病、冠心病、吸煙、飲酒、抑郁等〔9～11〕，還包括體質(zhì)指標(biāo):淀粉樣前體蛋白(APP)、氧化因子、炎癥因子、神經(jīng)生長因子(NGF)、氨基酸、tau蛋白和Aβ等，ApoE作為一個(gè)高危因素引起了研究人員的重視。

人群ApoE基因具有明顯的遺傳多態(tài)性，共有6種表型，是根據(jù)三種等位基因不同組合后產(chǎn)生的3種純合子E2/2、E3/3、E4/4和3種雜合子E3/2、E4/3、E4/2。當(dāng)前研究認(rèn)為ApoE基因與認(rèn)知功能的損傷存在很大的相關(guān)性，Borenstein等〔12〕研究認(rèn)為，E3/3等位基因的存在是認(rèn)知功能損害的危險(xiǎn)因素，與Niti等〔13〕研究結(jié)論一致;Unverzagt等〔14〕對非洲人種的基因狀況進(jìn)行研究，結(jié)果表明不存在種族的差異性;Erdan〔15〕、呂小榮等〔16〕學(xué)者對中國人群進(jìn)行研究，均認(rèn)為E3/3是高?；?，但對E2/2基因是否是低危因素還存在爭議。本次研究結(jié)論認(rèn)為ApoE等位基因?qū)φJ(rèn)知功能的損傷具有明顯的影響，與國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)論一致，但對E2/2基因攜帶者是否是先天性的低危人群還有待研究。本次研究雖然證明了ApoE基因?qū)夏耆苏J(rèn)知功能的影響，但還存在一定的局限性:(1)樣本量較小，樣本人群具有地域局限性;(2)未能評估Apo E基因?qū)夏耆苏J(rèn)知功能的相對危險(xiǎn)度，僅僅是定性研究。因此本次研究的結(jié)論還需要長期的大規(guī)模隨訪研究來證實(shí)。

1 王魯寧.老年人輕度認(rèn)知功能障礙的研究進(jìn)展〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2009;11(4):215-53.

2 Querfurth HW，LaFerla FM.Alzheimer's disease〔J〕.N Engl J Med，2010;362(4):329-44.

3 Jack CR Jr，Knopman DS，Jagust WJ，et al.Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer s pathological cascade〔J〕.Lancet Neurol，2010;9(1):119-28.

4 張耀東，徐 勇，聶宏偉，等.中國人群阿爾茨海默病載脂蛋白E基因多態(tài)性的Meta分析〔J〕.中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2011;11(4):433-6.

5 那族克，玉素甫，朱 沂.蒙特利爾認(rèn)知評估量表不同版本的介紹〔J〕.神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2010;10(2):516-9.

6 程懷東，汪 凱.國內(nèi)神經(jīng)心理學(xué)量表的運(yùn)用現(xiàn)狀及注意的問題〔J〕.安徽醫(yī)學(xué)，2009;30(2):143-4.

7 賴仁勝，謝 玲，申龍樹，等.表皮生長因子受體(egfr)基因測序檢測方法〔P〕.中國:CN1737162，2006-6-22.

8 Okello A，Koivunen J，Edison P，et al.Conversion of amyloid positive and negative MCI to AD over 3 years:an 11C-PIB PET study〔J〕.Neurology，2009;73(10):754-60.

9 馬 菲，苗汝捐，王 婷，等.社區(qū)輕度認(rèn)知功能損害老年人認(rèn)知減退影響因素的研究〔J〕.中華精神科雜志，2012;45(1):39-44.

10 方桂珍，陳雪萍，楊立江.925名社區(qū)老年人輕度認(rèn)知功能損害患病率及影響因素分析〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2009;28(6):512-5.

11 Elias-Sonnenschein LS，Viechtbauer W，Ramakers IH，et al.Predictive value of apo E4 allele for progression from MCI to AD-type dementia:a meta-analysis〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2011;82(10):1149-56.

12 Borenstein AR，Mortimer JA，Ding D，et al.Effects of apolipoprotein E-epsilon 4 And epsilon 2 in amnestic mild cognitive impairment and dementia in Shanghai:SCOBHI-P〔J〕.Am J Alzheimers Dis Other Demen，2010;25(3):233-8.

13 Niti M，Yap KB，Kua EH，et al.APOE-epsilon 4，depressive symptoms，and cognitive decline in Chinese older adults:Singapore Longitudinal Aging Studies〔J〕.Gerontol A Biol Sci Med Sci，2009;64(2):306-11.

14 Unverzagt FW，Ogunniyi A，Taler V，et al.Incidence and risk factors for cognitive impairment no dementia and mild cognitive impairment in African Americans〔J〕.Alzheimer Dis Assoc Disord，2011;25(1):4-10.

15 Erdan S，Apiradee L，Xipu L，et al.Apoliporprotein E gene and age-relate macular degeneration in a Chinese population〔J〕.Mol Vision，2011;17(8):997-1002.

16 呂小榮，鐘 遠(yuǎn).輕度認(rèn)知障礙及阿爾茨海默病與載脂蛋白E基因多態(tài)性的相關(guān)性〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012;32(3):917-9.