病毒樣顆粒疫苗在豬病防控中的應(yīng)用研究進(jìn)展

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

病毒樣顆粒疫苗在豬病防控中的應(yīng)用研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，李 峰，王 艷，沈志強(qiáng)

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

病毒樣顆粒（VLPs）疫苗因其免疫原性好、安全性好，已成為研制安全高效的預(yù)防人和動(dòng)物病毒性疾病的潛在候選疫苗。通過(guò)綜述VLPs疫苗在豬病防控中的應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為獸醫(yī)科技工作者和廣大養(yǎng)殖業(yè)主更好地了解VLPs疫苗提供參考。

病毒樣顆粒；疫苗；豬??；防控；研究進(jìn)展

病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）是由病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自動(dòng)組裝而成的空心顆粒，沒(méi)有病毒的核酸（DNA/RNA），不能自主復(fù)制，在形態(tài)上與天然病毒粒子相同或相似，俗稱偽病毒、假病毒[1]。VLPs不具有感染性，但具有很強(qiáng)的免疫原性，它可作為免疫原，通過(guò)和病毒感染機(jī)體一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞（T、B淋巴細(xì)胞），進(jìn)而有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)[2]。VLPs因其免疫原性好、安全性好，是研制安全高效的預(yù)防病毒病的潛在候選疫苗。迄今為止，國(guó)內(nèi)外針對(duì)人和動(dòng)物的病毒性疾病，在市場(chǎng)上使用和臨床研發(fā)中的VLPs疫苗至少35種以上[3]。目前，市場(chǎng)上還未有針對(duì)畜牧業(yè)常見疾病的VLPs疫苗，但是已經(jīng)開始了相關(guān)課題的研究。

1 VLPs在豬病防控中的應(yīng)用研究

1.1 豬細(xì)小病毒病

豬細(xì)小病毒（PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，PPV感染主要引起胚胎和胎兒死亡、重吸收、流產(chǎn)、木乃伊胎等，但母豬不表現(xiàn)明顯的癥狀。VP2是構(gòu)成PPV病毒粒子的主要衣殼蛋白，也是中和抗體作用的主要靶蛋白，具有良好的免疫原性，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行VP2的體外表達(dá)，可以在體外自我裝配形成VLPs。另外，VP2蛋白可以作為一種抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，攜帶外源表位，組裝成嵌合表位VLPs，嵌合表位VLPs免疫動(dòng)物具有雙重的免疫效果。Martine等[4]（1992）將PPV VP2基因克隆到桿狀病毒系統(tǒng)中，并成功地在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)，表明VP2多肽能夠自我裝配成VLPs，該研究為PPV新型亞單位疫苗的研究提供了新思路，而且PPV VLPs不僅自身可以作為疫苗，在外源多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)及多價(jià)疫苗的研制中也發(fā)揮重要作用。F.G.A. Adriaan等[5]（2006）用昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的PPV VP2基因產(chǎn)物制備VLPs疫苗，在添加免疫佐劑的情況下，VLPs疫苗可在豬體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的血清抗體。

1.2 口蹄疫

董艷美等[6]（2013）選擇了口蹄疫病毒（FMDV）O/HLJOC12/03毒株的VP1蛋白上關(guān)鍵的抗原決定簇第141～160位氨基酸對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，利用重疊延伸PCR（SOE-PCR）插入到MS2噬菌體的外殼蛋白基因的特定位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)FMDV的抗原決定簇多肽表達(dá)展示在MS2表面的VLPs。結(jié)果證實(shí)該VLPs蛋白可以很好地誘導(dǎo)被免疫的小鼠產(chǎn)生特異的抗體，且具有很好的免疫原性。該研究為進(jìn)一步開發(fā)出新型的FMD的VLPs疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。董虎等[7]（2014）將FLAG序列通過(guò)融合PCR技術(shù)插入FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1 GH-loop可變區(qū)，并通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)FMDV衣殼蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1，在體外組裝出嵌合FLAG外源多肽的VLPs，以期為研究制備多聯(lián)或多價(jià)FMDV的VLPs疫苗奠定基礎(chǔ)。潘群興等[8]（2010）為增強(qiáng)表位疫苗的免疫原性，為了研制開發(fā)免疫原性更好、成本低的新型疫苗，以PPV VP2病毒樣顆粒作為外源免疫原性多肽的分子載體，利用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)了O型FMDV VP1中T細(xì)胞表位肽嵌合的PPV VP2病毒樣顆粒[rPPV：VLP（FMDV）]。潘群興等[9]（2013）進(jìn)一步研究表明，該嵌合FMDV T抗原表位PPV VP2表達(dá)蛋白構(gòu)成的細(xì)小病毒樣顆粒，在無(wú)免疫佐劑存在的情況下免疫小鼠后，在低濃度FMDV抗原下能夠產(chǎn)生特異性T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，表明嵌合VLPs具有良好的免疫原性，這為在豬體進(jìn)行該VLPs的免疫研究以及不需要佐劑的顆?；呙绲难兄铺峁┝藢?shí)驗(yàn)依據(jù)，也為PPV、FMDV二聯(lián)因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1.3 豬偽狂犬病

國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者已應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出PPV的VP2蛋白及其自我裝配成的VLPs，但應(yīng)用偽狂犬病病毒（PRV）表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PPV的VP2蛋白及其自我裝配成的VLPs還鮮見報(bào)道。陳楊等[10]（2011）成功實(shí)現(xiàn)了利用PRV載體表達(dá)PPV的VP2蛋白的VLPs，通過(guò)IFA檢測(cè)了VP2基因在PRV中的表達(dá)，并通過(guò)電鏡觀察到了VP2基因表達(dá)產(chǎn)物可自我裝配成VLPs，且在1個(gè)細(xì)胞中可以同時(shí)觀察到PRV與PPV兩種VLPs，實(shí)現(xiàn)了利用PRV表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PPV的VP2蛋白的VLPs。若進(jìn)一步研究表明PRV SA215/VP2株可作為疫苗株，則通過(guò)培養(yǎng)PRV SA215/VP2就可以直接生產(chǎn)出PRV-PPV二聯(lián)疫苗，不需要滅活或分離PRV，并起到“一免多防”的功效，在生產(chǎn)成本方面也將極具優(yōu)勢(shì)。

1.4 豬瘟

豬瘟病毒（CSFV）是引起豬瘟的病原，相應(yīng)于其非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3的1446～1460氨基酸殘基的多肽E290，含有CSFV特異的輔助性T細(xì)胞表位和CTL細(xì)胞表位，在體液免疫和細(xì)胞免疫中均具有重要作用，為CSFV的免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位。范京惠等[11]（2007）將PPV的VP2基因克隆至真核表達(dá)載體pMel BacA 的XhoⅠ和KpnⅠ之間的多克隆位點(diǎn)，并在VP2基因的5'端插入CSFV的T細(xì)胞表位基因E290，在成功構(gòu)建了重組子pMVP2-E290陽(yáng)性質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，將其與Bac-N-Blue DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，形成的重組桿狀病毒在體外表達(dá)后，表達(dá)蛋白具有天然蛋白的生物學(xué)特性，且通過(guò)自我組裝后形成的VLPs，在無(wú)免疫佐劑的情況下免疫小鼠，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了高效價(jià)的抗PPV抗體及CSFV特異的CTL反應(yīng)，而且產(chǎn)生的抗PPV抗體效價(jià)顯著高于滅活疫苗免疫組。這為在豬體進(jìn)行此VLPs的免疫研究以及不需要佐劑的顆?；呙绲难兄铺峁┝嘶A(chǔ)資料。徐義剛等[12]（2007）用乳酸菌表達(dá)CSFV特異性的CTL表位E 290和PPV的VP2，口腔免疫豬，結(jié)果表明在沒(méi)有佐劑的條件下，重組的乳酸菌可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的黏膜免疫及CSFV特異性的CD8+型的CTL反應(yīng)，可以抵抗致死劑量的CSFV的攻擊。

1.5 豬乙型腦炎

豬乙型腦炎是日本腦炎病毒（JEV）引起的人畜共患傳染病。JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域III（EDIII）是誘導(dǎo)中和抗體的重要區(qū)域，EDIII的一個(gè)環(huán)肽（loop3）能通過(guò)干擾病毒吸附細(xì)胞抑制病毒感染。乙肝核心蛋白（HBC）是乙肝病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，它在細(xì)菌、真核細(xì)胞以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)均能被高效表達(dá)并自動(dòng)裝配成VLPs，是一種良好的表位展示免疫載體。而且在HBC特定位置插入的外源短肽序列不會(huì)影響HBC的構(gòu)象及自我組裝，同時(shí)插入的外源短肽能以多次重復(fù)的方式被展現(xiàn)在VLPs表面，從而能大大提高表位肽的免疫原性。李朋[13]（2013）首先構(gòu)建了以HBC為載體的重組融合表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HBC-loop3，在HBC的MIR區(qū)插入JEV EDIII loop3表位基因。結(jié)果證明了該VLPs抗原具有良好的免疫原性。PPV和JEV均是引起母豬繁殖障礙的主要病原。為了有效預(yù)防這2種病原引起的疫病，蔣春英[14]（2013）把JEV E蛋白上4個(gè)B細(xì)胞表位及2個(gè)T細(xì)胞表位基因與PPV結(jié)構(gòu)蛋白基因VP2串聯(lián)起來(lái)，構(gòu)建成VLPs [PPV：VLP（JEV）]，并在細(xì)菌中高效表達(dá)。重組蛋白純化后，體外組裝成VLPs后免疫小鼠研究其免疫原性。結(jié)果表明展示JEV多B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的PPV VLPs能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而為研究安全有效的JEV和PPV二聯(lián)基因工程疫苗提供了新的思路和方法。在目前應(yīng)用的一些弱毒疫苗和滅活疫苗存在缺陷和不足的情況下，該嵌合VLPs具有較大的潛在價(jià)值。

1.6 豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）為代表的系列疾病的病原，主要侵害6～12周齡的仔豬。PCV2的感染呈世界性分布，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要

病因之一。尹雙輝[15]（2011）首次利用E.coli表達(dá)的重組蛋白在體外制備Cap蛋白VLPs，為研制PCV2 VLPs疫苗奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果證明體外制備的PCV2 Cap VLPs疫苗有確實(shí)的刺激機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。李玲等[16]（2011）應(yīng)用Bac-to-Bac桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，獲得PCV2b的重組桿狀病毒。將該重組桿狀病毒感染HighFiveTM細(xì)胞后，VLPs在培養(yǎng)上清中的大量存在，為目的蛋白的分離和純化提供了便利，也為PCV2基因工程疫苗的產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。PPV不僅可引發(fā)嚴(yán)重的繁殖障礙性疾病，導(dǎo)致胚胎和胎兒死亡；而且能同PCV2混合感染，在PMWS感染中發(fā)揮著重要作用。Pan等[17]（2008）運(yùn)用PPV VP2 VLPs作為表位展示載體，在VP2的N端插入PCV2主要T細(xì)胞抗原表位，轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，在腺病毒表達(dá)載體中成功表達(dá)出嵌合VLPs［PPV：VLP（PCV2）］；將該帶有PCV2抗原表位的PPV顆粒在無(wú)免疫佐劑參與的情況下免疫小鼠，嵌合的VLPs不僅能誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生PCV2特異性的CTL反應(yīng)，還能刺激小鼠產(chǎn)生高效價(jià)的PPV特異性抗體。朱玲等[18]（2010）選擇PPV VP2蛋白的2個(gè)位點(diǎn)插入PCV2 ORF2蛋白，構(gòu)建2個(gè)不同的重組體，結(jié)果獲得期望中的具有良好免疫原性的[PPV VP2：PCV2 ORF2]重組VLPs，同時(shí)也揭示PPV VPLs的N端1/3適于外源蛋白插入構(gòu)建重組VLPs。

1.7 豬藍(lán)耳病

李楊[19]（2012）利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了PRRSV GP2b、GP5、M和N蛋白，并證實(shí)共表達(dá)GP5和M蛋白可組裝成VLPs，而GP2b有助于VLPs的釋放。

1.8 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床癥狀的高度傳染性疾病，尤其對(duì)2周齡以內(nèi)的仔豬具有很高的致死率，死亡率可達(dá)100%。該病呈世界性分布，給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)均造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Baudoux等[20]（1998）研究表明，體外共表達(dá)TGEV的M、sM蛋白可形成VLPs，且病毒粒子被釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中。M蛋白與sM蛋白形成的VLPs能夠誘導(dǎo)IFN-α的產(chǎn)生，具有防御TGEV的感染的作用。冷勇等（2013）[21]、宋振輝等[22]（2014）研究利用家蠶Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了TGEV的M蛋白、sM蛋白和N蛋白的重組桿狀病毒，VLPs的體外組裝試驗(yàn)表明在sf9細(xì)胞內(nèi)M蛋白單獨(dú)表達(dá)，M蛋白和sM蛋白共表達(dá)，M蛋白和N蛋白共表達(dá)，都可形成VLPs，且VLPs大小不等。這為進(jìn)一步研究TGEV的裝配提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)材料。

2 存在的問(wèn)題與展望

VLPs疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，其具有強(qiáng)大的免疫優(yōu)勢(shì)：表面結(jié)構(gòu)規(guī)則，大小合適，不含核酸，不能自主復(fù)制，不具有傳染性，易于被免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生很好的免疫效果；在血清中的半衰期較長(zhǎng)；質(zhì)量穩(wěn)定、安全可靠等等。這極大地吸引了眾多疫苗研發(fā)者的目光。VLPs作為免疫原與病毒顆粒一樣，在沒(méi)有佐劑的情況下，低劑量也能激起高效的免疫反應(yīng)，這將有利于打破腫瘤和病毒慢性感染所產(chǎn)生的免疫耐受，使VLPs展示表位疫苗具備直接用于治療的特性。因此，VLPs作為一種新型疫苗，不僅克服了傳統(tǒng)疫苗的不足，而且也彌補(bǔ)了基因疫苗的缺憾，是目前最有發(fā)展前景的預(yù)防兼治療的候選疫苗，在腫瘤、傳染病、過(guò)敏性疾病的預(yù)防和治療上展現(xiàn)了廣闊的前景，為科學(xué)研究開辟了新的探索領(lǐng)域。然而VLPs作為預(yù)防性疫苗還有很多問(wèn)題需要探索。如表達(dá)系統(tǒng)的選擇、VLPs組裝效率的提高以及病毒變異帶來(lái)的免疫逃避；建立多基因共表達(dá)載體的難度大，各個(gè)基因表達(dá)量的比例難以控制；VLPs作為疫苗多是幾種型特異性多價(jià)疫苗，而多價(jià)苗之間的量效關(guān)系確定較為復(fù)雜；有的VLPs必需在添加佐劑后才能達(dá)到免疫效果，而佐劑和VLPs的劑量比例關(guān)系需要進(jìn)一步驗(yàn)證；VLPs作為疫苗的最佳免疫途徑、劑量和保護(hù)作用的確切評(píng)價(jià)還無(wú)定論；VLPs疫苗的免疫效果與全病毒疫苗（滅活苗或弱毒苗）接近，但在交叉免疫方面仍然存在缺陷等等。雖然VLPs疫苗存在諸多不足，但是基于VLPs構(gòu)建多價(jià)或嵌合疫苗具有廣闊的前景，相信隨著以上問(wèn)題的逐步解決，更多VLPs疫苗的成功問(wèn)世指日可待。

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2015-02-03）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-06-022-15）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制