尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白podocalyxin在腎病綜合征合并急性腎損傷診斷中的價(jià)值

王福珍，丘昭文，朱杰，吳森超，林沖云，王朝暉

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院腎內(nèi)科，福建 龍巖 364000；2.上海師范大學(xué)數(shù)理學(xué)院，上海 200234；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200025）

·臨床論著·

尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白podocalyxin在腎病綜合征合并急性腎損傷診斷中的價(jià)值

王福珍1，丘昭文1，朱杰2，吳森超1，林沖云1，王朝暉3

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院腎內(nèi)科，福建 龍巖 364000；2.上海師范大學(xué)數(shù)理學(xué)院，上海 200234；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200025）

目的探討原發(fā)性腎病綜合征（PNS）患者尿液中podocalyxin（PCX）的變化對急性腎損傷（AKI）的診斷價(jià)值。方法對PNS合AKI患者（n=33例，AKI組）和未合并AKI患者（n=24例，非AKI組）尿液PCX、血清半胱氨酸蛋白酶抑制物C（Cystatin C，Cys C）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和血漿清蛋白（ALB）水平進(jìn)行檢測，觀察上述指標(biāo)與病情關(guān)系。結(jié)果AKI組尿PCX（42.04±11.01）ng/ml顯著高于非AKI組（30.88±9.93）ng/ml；血清Cys C水平（1.91±0.54）mg/L顯著高于非AKI組（1.29±0.34）mg/L，而血清LDL-C和血漿ALB水平在兩組中比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著AKI病情加重，估算的腎小球?yàn)V過率（eGFR）的減少，尿PCX、血清Cys C增加更為明顯。結(jié)論聯(lián)合檢測原發(fā)性腎病綜合征患者尿PCX、血清Cys C有助于AKI的診斷及病情判斷。

尿液；podocalyxin；腎病綜合征；急性腎損傷

原發(fā)腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）常合并急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。AKI會(huì)加重患者病情，增加治療難度和病死率。它可發(fā)生于PNS病程中的任何階段。若能及時(shí)診斷，合理治療，大部分患者腎功能可好轉(zhuǎn)，預(yù)后較好，但也有少數(shù)病例發(fā)展為慢性腎衰竭，需要終生替代治療。因此，探索PNS合并AKI的早期診斷生物學(xué)標(biāo)志物是臨床研究的重要問題。PNS常常伴有足細(xì)胞的病變，因此，我們試圖通過檢測PNS患者尿液中足細(xì)胞標(biāo)志蛋白之一podocalyxin的水平來分析其與PNS合并AKI之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2011年1月-2013年3月福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院腎內(nèi)科住院的PNS患者。其中，男32例，女25例；年齡20～65歲，平均（30.5± 8.5）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參加者均簽署知情同意書。自PNS發(fā)?。ɑ驈?fù)發(fā)）至入院時(shí)間為3～30 d，其中，33例合并急性腎損傷，24例腎功能正常作為對照組。所有病例均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①24 h尿蛋白定量＞3.5 g/d，血漿白蛋白＜30 g/L，伴或不伴水腫，高脂血癥；②排除繼發(fā)性腎病綜合征（如狼瘡性腎炎、乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎、過敏性紫癜性腎炎、腎淀粉樣變和糖尿病腎病等繼發(fā)性腎臟病變）；③所有病例均進(jìn)行了腎活組織病理檢查。

1.2AKI的診斷

按2012年KDIGO指南的診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)，即48 h內(nèi)血肌酐上升≥0.3 mg/L或較原先水平增高50%；和（或）尿量＜0.5 ml/（kg·h）持續(xù)6 h以上（排除梗阻性腎病或脫水狀態(tài)）；并分為1～3期。1期為清肌酐升高達(dá)基礎(chǔ)值的1.5～1.9倍，或升高值≥26.5μmol/L（0.3 mg/dl），和（或）尿量＜0.5 ml/（kg·h）持續(xù)6～12 h；2期為血清肌酐升高達(dá)基礎(chǔ)值的2.0～2.9倍，和（或）尿量＜0.5 ml/（kg·h）持續(xù)12 h以上；3期為血清肌酐升高達(dá)基礎(chǔ)值的3.0倍，或血肌酐升高至≥353.6 umol/L，開始腎臟替代治療，和（或）尿量＜0.3 ml/（kg·h）持續(xù)24 h以上，或者無尿持續(xù)12 h及以上。

1.3研究方法

1.3.1分組方法每個(gè)研究對象入院時(shí)立即留取1次血液及尿液標(biāo)本，入院時(shí)合并AKI患者以入院時(shí)腎功能所處分期列入相應(yīng)分組，住院期間腎功能正常者列為對照組（非AKI組），住院期間出現(xiàn)急性腎損傷者列入腎損傷組（AKI組）。

1.3.2標(biāo)本采集所有受試者取空腹靜脈血10 ml，采用西門子全自動(dòng)生化分析儀測定血清肌酐、血清Cys C、血清總膽固醇、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和血漿清蛋白（ALB）。留取24 h尿，記錄尿量后從中取出10 ml尿標(biāo)本，尿蛋白定量采用鄰苯三酚紅比色測定法。

1.3.3尿podocalyxin的檢測采用CUSABIO有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測尿PCX。具體操作步驟如下：留取腎病患者清潔中段晨尿10 ml，用無菌管收集尿液于2～8℃1 000×g離心15 min取上清用于實(shí)驗(yàn)。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100μl，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37℃溫育2 h。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200μl/每孔，甩干。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200μl/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色15～30 min。依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

數(shù)據(jù)處理將標(biāo)準(zhǔn)品及樣本值減去SO孔數(shù)值后繪制曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣本OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度。

1.3.4eGFR的計(jì)算采用針對中國慢性腎臟病患者改良的簡化MDRD公式來評算腎小球?yàn)V過率[1]，即eGFR（ml/min/1.73 m2）=175×[Scr（mg/dl）]-1.234×年齡-0.179×（女性×0.79）

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1腎病綜合征合并與不合并急性腎損傷患者的各項(xiàng)臨床指標(biāo)比較

與非AKI組相比較，AKI組患者尿PCX、血Cys C、血肌酐、血尿酸和血纖維蛋白原的水平明顯升高（均P＜0.001），eGFR值顯著下降（P＜0.001）。AKI組患者使用利尿劑人數(shù)高于非AKI組（P＜0.001）。AKI組患者收縮壓高于非AKI組（P＜0.001），舒張壓兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他指標(biāo)如年齡、病程、尿蛋白定量、血總膽固醇、血低密度脂蛋白膽固醇和血纖維蛋白原等，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者的基線情況比較（±s）

組別年齡/歲月使用利尿劑/%收縮壓/mmHg舒張壓/mmHg尿蛋白定量/（g/24 h）血漿清蛋白/（g/L）AKI組（n=33）31.2±7.929/143.21±2.2248.48%137±2184±135.22±2.0718.83±3.66非AKI組（n=24）33.1±9.224/103.58±1.6420.83%125±1982±115.55±2.5719.56±4.97 P值0.3350.297＜0.001＜0.0010.1130.2850.166男/女病程/組別血總膽固醇/ mmol/L血低密度脂蛋白膽固醇/(mmol/L）纖維蛋白原/(g/L）血尿酸/(μmol/L）血肌酐/(μmol/L)血Cys C/(mg/L）eGFR/[ml/（min·1.73 m2）]尿PCX/(ng/ml）AKI組（n=33）8.85±3.126.67±2.656.87±1.74498.36±175.73 194.38±31.011.91±0.5421.33±8.8542.04±11.01非AKI組（n=24）9.21±2.647.80±2.994.59±1.57396.57±165.7874.38±9.521.29±0.3484.07±10.5130.88±9.93 P值0.0970.102＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2各項(xiàng)指標(biāo)與急性腎損傷嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

隨著急性腎損傷病情加重，尿PCX、血Cys C和血肌酐逐漸升高（P＜0.05），尿PCX、血Cys C和血肌酐隨著eGFR的減少呈負(fù)相關(guān)（其中，尿PCXr= -0.553，P＜0.001；血Cys Cr=-0.78，P＜0.001；血肌酐r=-0.867，P＜0.001）。見圖1～3。

2.3各項(xiàng)指標(biāo)與急性腎損傷嚴(yán)重程度（AKI分期）單因素方差分析

把33例合并急性腎損傷患者，根據(jù)KDIGO關(guān)于AKI指南的診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)分為AKI1期、2期和3期，比較各期患者尿PCX、血Cys C和血肌酐值的差異性。結(jié)果表明急性腎損傷腎功能受損程度越高，患者尿PCX、血CysC和血肌酐值的水平也越高，各期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，AKI 3期與1期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）、AKI 3期與2期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009），但AKI 2期與1期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.063）；Cys C指標(biāo)AKI各期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，AKI 1期與3期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.001），但AKI 2期與1期（P=0.090）、AKI 3期與2期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.136）。

表2 合并急性腎損傷患者腎功能狀況與各指標(biāo)之間的關(guān)系（±s）

注：1）與1期比較，P＜0.05，2）與2期比較，P＜0.05

AKI分期血肌酐/（μmol/L）1期（n=14）185.59±28.372）2期（n=10）278.53±43.151）3期（n=9）366.37±34.241）2）尿PCX/（ng/ml）血Cys C/（mg/L）34.5±7.922）1.58±0.422）42.11±6.601）1.94±0.351）53.68±9.041）2）2.38±0.551）2）

3 討論

AKI是原發(fā)性腎病綜合征的常見并發(fā)癥之一。長期以來血肌酐、尿素氮一直是作為反映腎損傷最主要的生物標(biāo)志物，但上述兩項(xiàng)具有局限性，主要原因：血肌酐和尿素氮的水平升高常發(fā)生于腎損傷后數(shù)天至數(shù)周，無法監(jiān)測腎臟的早期病變；血肌酐和尿素氮的血液蓄積只與腎小球?yàn)V過率下降相關(guān)，并不能反映腎小管的損傷、壞死；血肌酐和尿素氮水平變化容易受年齡、性別、種族、飲食、身體狀況及藥物等多因素的影響，不能真實(shí)反映早期腎功能受損情況[2-3]。所以，倘若單純依靠血肌酐、尿素氮的檢測可能延誤AKI的早期診斷及治療。

足細(xì)胞位于腎小球毛細(xì)血管壁最外層，以其次級突起即足突和基底膜相連，足突間有裂隙隔，其上覆蓋的裂隙隔膜是構(gòu)成腎小球血液濾過屏障的主要成分。足細(xì)胞受損后從腎小球基底膜脫落破壞濾過膜的完整性，是蛋白尿發(fā)生的病理基礎(chǔ)之一。足細(xì)胞的破壞反映了腎小球的損害程度[4-5]。足細(xì)胞的足突和裂隙隔膜的多個(gè)蛋白分子逐漸被認(rèn)識(shí)，PCX是足細(xì)胞表達(dá)的一種特異蛋白分子，其正常表達(dá)能防止帶負(fù)電荷的蛋白分子漏人原尿中。VITUREIRA等認(rèn)為尿液PCX可監(jiān)測腎小球損傷的活動(dòng)性，認(rèn)為尿沉渣PCX水平是評估急性腎小球損傷的嚴(yán)重性的可靠實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[6]。有研究表明糖尿病患者尿PCX水平較健康人組明顯增高，且隨著病情加重，糖尿病病程的延長，其尿PCX水平出現(xiàn)明顯的增加[7]。亦有研究表明，IgA腎病病程中尿足細(xì)胞陽性預(yù)示病情進(jìn)展，而陰性則標(biāo)志著病情穩(wěn)定或緩解[8]。本研究證實(shí)原發(fā)性腎病綜合征合并AKI患者，尿中可以檢測到尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白PCX。在PNS合并AKI組中尿PCX較對照組明顯增高，說明尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白是AKI的良好標(biāo)志物。為了觀察急性腎損傷的嚴(yán)重程度與尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白是否有相關(guān)性，本研究設(shè)置了AKI不同分期組比較觀察尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白，研究顯示隨著急性腎損傷程度的逐漸加重，尿PCX濃度逐漸升高，在急性腎損傷3期與1、2期差異有顯著性，但1期與2期差異無顯著，提示尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白對AKI嚴(yán)重程度及預(yù)后評估有重要作用。尿PCX為無創(chuàng)性檢查，且簡單、快捷。

1983年ANASTASI等首次在雞蛋清中分離到高純度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cysteine proteinase inhibitor，CPI），之后被命名為胱抑素C。它能在幾乎所有的有核細(xì)胞內(nèi)以恒定的速度持續(xù)地轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，無組織學(xué)特異性，故在體內(nèi)以恒定速度產(chǎn)生[9]。循環(huán)中的胱抑素C僅經(jīng)腎小球?yàn)V過而被清除，是一種反映腎小球?yàn)V過率變化的內(nèi)源性標(biāo)志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代謝分解，不返回血液，因此，其血中濃度由腎小球?yàn)V過決定，而不依賴任何外來因素，如性別、年齡、飲食的影響，是一種反映腎小球?yàn)V過率變化的理想同源性標(biāo)志物。目前大量研究資料已顯示，Cys C比BUN、血Cr具有更高的敏感性和特異性，在評價(jià)腎小球?yàn)V過率中具有重要的價(jià)值，已被公認(rèn)為是腎功能早期損傷的標(biāo)志物之一。本研究顯示在PNS合并急性腎損傷時(shí)血Cys C明顯升高，AKI組和對照組有顯著性差異。同時(shí)本研究觀察在AKI不同分期中的血Cys C水平，顯示AKI1期與AKI3期有顯著差異，但相鄰兩期差異無顯著，隨著急性腎損傷病程進(jìn)展，血Cys C水平呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。血中Cys C對PNS合并AKI的診斷及病情觀察具有重要的臨床意義

理論上PNS患者ALB越低，血管內(nèi)有效血容量相對不足，腎間質(zhì)水腫越明顯，加重腎損傷。近年來對于高脂加重腎小球進(jìn)行性硬化的作用十分受重視。本研究同時(shí)觀察血LDL-C、ALB水平與急性腎損傷的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)在急性腎損傷組與對照組之間，及急性腎損傷各期間無顯著差異。本研究提示PNS中血脂與血白蛋白的水平與AKI無相關(guān)性。

本組病例分析中還可觀察到利尿劑的不適當(dāng)使用可能是導(dǎo)致急性腎損傷的一個(gè)原因。由于腎病綜合征患者因低蛋白血癥往往腎臟有效血容量不足，此時(shí)若不適當(dāng)?shù)剡^度利尿，將導(dǎo)致腎臟血流灌注明顯減少，從而影響腎小球?yàn)V過率，促進(jìn)急性腎損傷的發(fā)生。

綜上所述。在PNS患者中，聯(lián)合檢測尿PCX和血清胱抑素可以為PNS合并AKI的防治提供依據(jù)。通過本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，對PNS患者檢測尿PCX、血Cys C有助于及早發(fā)現(xiàn)AKI，并反映AKI病情嚴(yán)重程度。上述兩項(xiàng)檢測指標(biāo)具有無創(chuàng)、可操作性強(qiáng)、敏感等特點(diǎn)，有助于了解PNS合并AKI的發(fā)病機(jī)制，也為臨床預(yù)測PNS中AKI提供新的檢測指標(biāo)。

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Urinary podocalyxin as a marker of primary nephrotic syndrome complicated with acute kidney injury

Fu-zhen WANG1,Zhao-wen QIU1,Jie ZHU2,Sen-chao WU1,Chong-yun LIN1,Chao-hui WANG3
(1.Department of Nephrology,the First Hospital of Lonyan,Fujian Medical University,Longyan, Fujian 364000,P.R.China;2.Mathematics and Science College,Shanghai Normal University, Shanghai 200234,P.R.China;3.Department of Nephrology,Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,P.R.China)

【Objective】To explore the diagnostic value of acute kidney injury(AKI)in the changes of primary nephrotic syndrome(PNS)patient's urine podocalyxin(PCX).【Methods】The concentration of urine PCX and serum CystatinC(CysC)and serum low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C)and albumin(ALB)is detected in the group of PNS with AKI(n=33 cases)and the group of PNS without AKI(n=24 cases).Then we observe the relation between the index above-mentioned and the patient's condition.【Results】The urine PCX and serum CysC in the group of PNS with AKI are significant higher than the group of PNS without AKI.There is no significant difference of the serum LDL and ALB in the two groups.As the patient's condition become more serious and the estimation glomerular filtration rate(eGFR)become fewer,the increasing of urine PCX and serum CysC is more evident.【Conclusions】The conjoined detection of urine podocalyxin and serum CysC in the PNS patients is beneficial to early diagnosis and judgment of patient's condition of AKI.

urine;podocalyxin;nephrotic syndrome;acute kidney injury ?

R692

A

1005-8982（2015）28-0036-05

2015-06-03

林沖云，E-mail：lingchongyun@163.com