大鼠自體動(dòng)脈血腦出血模型的改良

大鼠自體動(dòng)脈血腦出血模型的改良

韓偉一陳濤利1陶英群2

(遼寧醫(yī)學(xué)院沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧沈陽(yáng)110840)

摘要〔〕目的建立一種簡(jiǎn)單易行且穩(wěn)定性、重復(fù)性好的大鼠自體動(dòng)脈血腦出血模型。方法取20只SD大鼠平均分為模型組(10只)和對(duì)照組(10只)。大鼠尾動(dòng)脈置管抽取新鮮動(dòng)脈血，采用立體定向技術(shù)，通過24 G靜脈留置針向大鼠右側(cè)尾狀核內(nèi)注入15、35 μl大鼠自體動(dòng)脈血。觀測(cè)兩組大鼠血腫形態(tài)和血腫容積，進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。結(jié)果兩組大鼠右側(cè)尾狀核內(nèi)均可見血腫形成。模型組大鼠的血腫形成率高，形態(tài)規(guī)則，占位效應(yīng)明顯，平均血腫容量為(43.6±6.7)ml，對(duì)照組為(34.1±10.3)ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組行為學(xué)評(píng)分與對(duì)照組無(wú)差異。結(jié)論該模型與臨床腦出血相似，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，是腦出血實(shí)驗(yàn)研究和治療干預(yù)研究的理想模型。

關(guān)鍵詞〔〕腦出血；立體定向

中圖分類號(hào)〔〕R743〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：遼寧省科技攻關(guān)課題(2011225021)

通訊作者：陶英群(1973-)，男，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事功能神經(jīng)外科及腦出血的微創(chuàng)手術(shù)治療研究。

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院

2沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科全軍神經(jīng)醫(yī)學(xué)研究所

第一作者：韓偉一(1988-)，男，在讀碩士，主要從事腦出血的基礎(chǔ)與臨床研究。

在腦出血的實(shí)驗(yàn)研究中，建立一種簡(jiǎn)單易行且穩(wěn)定性、重復(fù)性好的腦出血模型極為關(guān)鍵。大鼠自體動(dòng)脈血腦出血模型由于操作簡(jiǎn)單且與臨床腦出血病理生理相似故被廣泛應(yīng)用，但仍有許多不足之處。本實(shí)驗(yàn)力求構(gòu)建一種更為理想而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)哪X出血大鼠模型。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及分組清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，體重250～350 g，第二軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，以標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用純凈水喂養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為動(dòng)物中心多層層流架，恒溫(20℃～25℃)。隨機(jī)均分2組，模型組采用二次取血二次注血二次退針法；對(duì)照組采用一次取血二次注血一次退針法。

1.2實(shí)驗(yàn)材料數(shù)字立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，牙科鉆(307-6型 上海齒科醫(yī)械廠)，電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，Mias2000圖像分析系統(tǒng)，50 μl微量注射器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)，針頭均更換為0.7 mm內(nèi)徑接頭，可直接與切去接頭的靜脈留置針套管緊密結(jié)合；24G靜脈留置針，手術(shù)器械一套，10%水合氯醛等。

1.3模型制作

1.3.1立體定向定位大鼠術(shù)前8 h禁食，不禁水。稱重后以10%水合氯醛400 mg/kg腹腔麻醉，俯臥位，備皮后固定大鼠于立體定向儀上，使門齒溝平面比耳間線平面低2.4 mm。局部皮膚消毒、鋪洞巾，從頭部正中皮膚切開約2 cm的縱行切口，30%過氧化氫腐蝕以暴露前囟及冠狀縫，靶點(diǎn)定位于前囟前0.21 mm，右側(cè)中線旁開3 mm，顱骨外表面下6 mm。進(jìn)針點(diǎn)用牙科鉆鉆孔，穿透顱骨至硬腦膜但不傷及腦組織，直徑約1 mm。將靜脈留置針沿鉆孔方向垂直進(jìn)針6 mm至靶點(diǎn)，用瞬間粘合劑將留置針固定于顱骨，拔除針芯，切除套管針接頭。

1.3.2尾動(dòng)脈置管鼠尾提前在溫水中浸泡10 min，取尾部上1/3段，刮除角質(zhì)磷片后消毒鋪巾。沿腹側(cè)正中縱行切開皮膚2 cm，在手術(shù)顯微鏡下剝離出鼠尾動(dòng)脈，游離尾動(dòng)脈約1 cm，動(dòng)脈夾夾閉遠(yuǎn)端，下墊一手術(shù)刀柄，待充血后夾閉近端，在管壁上作一切口，在手術(shù)顯微鏡下將24G靜脈留置針置于尾動(dòng)脈中約2 cm，近端斷開動(dòng)脈夾并結(jié)扎固定。

1.3.3自體血注入右側(cè)尾狀核用微量進(jìn)樣器經(jīng)留置針尾部抽取15 μl動(dòng)脈血，迅速連接顱部套管針以10 μl/min的速度注入靶點(diǎn)，5 min后以同樣方法取血35 μl并注入靶點(diǎn)，2 min內(nèi)注完。留針約5 min，先緩慢退針2 mm，停針約3 min后緩慢退出套管針。對(duì)照組采用尾動(dòng)脈穿刺抽血，一次取血50 μl，先注入15 μl(10 μl/min)，停頓2 min，再注入35 μl(2 min)完成造模。取血完成后用乙醇棉球消毒，用紗布包扎鼠尾部傷口，術(shù)后用骨蠟封閉顱骨創(chuàng)口，縫合頭皮，局部皮膚用碘酚消毒。

1.4行為學(xué)觀察參照Longa〔1〕五級(jí)評(píng)分法，在大鼠術(shù)后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。1～3分為造模成功。

1.5血腫形態(tài)學(xué)觀察及血腫容積測(cè)定兩組大鼠術(shù)后24 h處死，用4%多聚甲醛灌注固定，將腦組織切成冠狀序列切片，層厚1.0 mm。采用Mias2000圖像分析系統(tǒng)，分別測(cè)定每個(gè)層面血腫最長(zhǎng)直徑及面積并計(jì)算出血腫容積。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能評(píng)分模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分為(2．3±0．82)分，對(duì)照組為(1.6±1.17)分，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2血腫形態(tài)觀察模型組所有大鼠尾狀核內(nèi)均見血腫形成，血腫局限在尾狀核內(nèi)，呈圓形或橢圓形，形態(tài)較規(guī)則，占位效應(yīng)明顯；其中1例標(biāo)本針道見少量血液反流，但未進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下隙及腦室。對(duì)照組8只大鼠有血腫形成，血腫不規(guī)則，4例標(biāo)本針道見少量血液反流，2例破入腦室，無(wú)血腫形成。

2.3血腫直徑容量模型組與對(duì)照組大鼠血腫最大直徑〔(4.4±0.9)mm、(3.6±0.6)mm〕差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血腫容量模型組〔(43.6±6.7)ml〕大于對(duì)照組〔(34.1±10.3)ml〕(P<0．05)，均小于注入血液總量。

3討論

大鼠腦出血模型的研究開始于上世紀(jì)80年代。目前實(shí)驗(yàn)性腦出血?jiǎng)游锬Ｐ椭饕?種：自體血注入腦出血模型、膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型、微球囊充脹壓迫腦出血模型〔2,3〕和自發(fā)性腦出血模型〔4〕。1990年Rosenberg等〔5〕建立膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型，其最大的缺點(diǎn)是出血過程緩慢，出血多為滲出性，并非實(shí)質(zhì)性的血腫，占位效應(yīng)不明顯；微球囊腫脹壓迫腦出血模型僅有占位效應(yīng)，缺點(diǎn)明顯，與臨床腦出血存在較大差異，目前已基本不再使用；自發(fā)性腦出血模型與臨床腦出血最接近,但是造價(jià)昂貴，出血部位及出血量無(wú)法控制，在腦出血實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用受到限制。自體動(dòng)脈血注入腦尾狀核制作的大鼠腦出血模型，因操作簡(jiǎn)單易行，形成的血腫具有良好的穩(wěn)定性及可重復(fù)性而在實(shí)踐中應(yīng)用廣泛，是理想的腦出血模型〔6〕。

目前制作大鼠自體動(dòng)脈血腦出血模型面臨的主要問題是：①取血：取血部位大致有心臟、頸動(dòng)脈、股動(dòng)脈和尾動(dòng)脈，從股動(dòng)脈取血?jiǎng)?chuàng)傷較大且嚴(yán)重影響后期的行為學(xué)評(píng)分〔7〕；尾動(dòng)脈剪尾取血易造成動(dòng)脈血、靜脈，而采用尾動(dòng)脈抽血?jiǎng)t難度很大，很難保證所需的血量〔8〕。②注血:理論上講，大鼠尾狀核注射50 μl血相當(dāng)于人腦40 ml的出血量，有學(xué)者認(rèn)為需要注射100 μl血才能保證血腫的穩(wěn)定性，避免出現(xiàn)針道反流情況〔9〕。為了避免兩次注血過程中血液凝固，有研究者使用了肝素沖管，而使用肝素后會(huì)影響血液中凝血酶的作用，凝血酶在腦出血后會(huì)釋放毒物，對(duì)腦組織造成二次損傷〔8〕。

二次取血二次注血二次退針法模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：①尾動(dòng)脈置管取血保證了每次注入的血液為新鮮動(dòng)脈血且不影響后期行為學(xué)評(píng)分。②避免了使用膠原酶和肝素帶來(lái)的外源性物質(zhì)影響〔10〕。③能夠保證血腫的穩(wěn)定性，最大限度避免針道反流，兩次注血之間5 min的停頓時(shí)間可以有效地防止反流〔11〕。④注血50 μl即能滿足實(shí)驗(yàn)需要。⑤置入尾狀核內(nèi)的靜脈留置針還可以進(jìn)一步用于腦出血的藥物干預(yù)治療。經(jīng)過驗(yàn)證，本模型簡(jiǎn)單易行，穩(wěn)定性和可重復(fù)性強(qiáng)，符合臨床腦出血的病理生理過程，是腦出血基礎(chǔ)研究及藥物干預(yù)研究的理想模型，有很強(qiáng)的推廣性。

4參考文獻(xiàn)

1Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

2Deinsberger W,Vogel J,Fuchs C,etal.Fibrinolysis and aspiration of experimental intracerebral hematoma reduces the volume of ischemic brain in rats〔J〕.Neurol Res,1999;21(4):517-23.

3Sinar EJ,Mendelow AD,Graham DI,etal.Experimental intracerebral hemorrhage:effects of a temporary mass lesion〔J〕.J Neurosurg,1987;66(5):568-76.

4Zeng J,Zhang Y,Mo J,etal.Two-kidney,two clip renovascular hypertensive rats can be used as stroke-prone rats〔J〕.Stroke,1998;29:1708-13.

5Rosenberg GA,Mun-Bryce S,Wesley M,etal.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats〔J〕.Stroke,1990;21(7):801-7.

6Bullock R,Mendelow AD,Teasdale GM,etal.Intracranial haemorrhage induced at arterial pressure in the rat.Part 1:description of technique,ICP changes and neuropathological fidings〔J〕.Neurol Res,1984;6(2):184-8.

7Nath FP,Jenkins A,Mendelow AD,etal.Early hemodynamic changes in experimental intracerebral hemorrhage〔J〕.J Neurosurg,1984;65(6):697-703.

8Liu CM,Shi BZ,Zhou JS.Effects of thrombin on the secondary cerebral injury of perihematomal tissues of rats after intracerebral hemorrhage〔J〕.Genet Mol Res,2014;13:4617-26.

9Yang GY,Betz AL,Chenevert TL,etal.Experimental intracerebral hemorrhage:relationship between brain edema,blood flow,and blood-brain barrier permeability in rats〔J〕.J Neurosurg,1994;81(1):93-102.

10Lu Q,Gao L,Huang L,etal.Inhibition of mammalian target of rapamycin improves neurobehavioral deficit and modulates immune response after intracerebral hemorrhage in rat〔J〕.J Neuroinflammation,2014;11:44.

11呂田明,陸兵勛.大鼠尾狀核注射凝固自體動(dòng)脈血腦出血模型〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2006;23(1):88-90.

〔2015-03-17修回〕

(編輯郭菁)