中藥藥效物質基礎的研究進展

尚沛津，李玉文，張一愷，王莎莎，王若琳，文愛東（第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，西安 710032）

中藥復雜的成分和不甚明確的作用機制無疑是制約其發(fā)展的兩大難題。其成分復雜主要體現(xiàn)在以下幾個方面：（1）固有化學物質種類多；（2）炮制和加工過程中，藥物相互反應產生新的化合物[1-2]；（3）經人體代謝產生的有生物活性的新的化合物；（4）經人體微生物代謝產生的新的化合物[3]。其機制多樣主要體現(xiàn)在：（1）多種成分作用于一個相同的靶標，產生協(xié)同作用[4]；（2）調節(jié)人體內酶的活性，影響物質轉運，降低血漿清除速率，延長作用時間，提高生物利用度；（3）克服藥物抵抗作用，尤其是針對微生物感染和抗腫瘤治療過程中產生的藥物抵抗和多種藥物耐受的現(xiàn)象。

中藥作為一個整體發(fā)揮藥效，且整體藥效優(yōu)于任何單體或拆分單體，如黃連中含多種生物堿，其綜合作用強于其中任何一種單體[5]。該理論突出了中藥多成分、多靶點、散彈式綜合治療的優(yōu)越性，但對中藥的研究也構成了非常大的困難和挑戰(zhàn)。迄今為止，中藥藥效物質基礎研究還未能建立一種行之有效的現(xiàn)代化檢測體系。我們不能再停留在用西藥思維方式研究中藥的怪圈，應該結合中醫(yī)藥理論，從整體上尋找適合中藥藥效物質基礎研究的新方法、新手段[6]。筆者以“中藥”“中藥發(fā)展”“藥效物質基礎”“Traditional chinese medicine”“Material basis of efficacy”為關鍵詞，組合查詢2006－2014 年中國生物醫(yī)學、中國知網(wǎng)、PubMed 數(shù)據(jù)庫，得到相關文獻94條，其中有效文獻41條。對文獻進行分析歸納后，就中藥藥效物質研究方法和多元化中藥指紋圖譜建立兩個方面作如下綜述，以期為實現(xiàn)中藥的質量控制和標準化管理、開發(fā)多靶點綜合治療藥物和中藥現(xiàn)代化提供理論參考。

1 中藥藥效物質研究方法

1.1 體外提取藥效學研究

中藥體外提取是方劑研究過程中經典的必不可少的環(huán)節(jié)，分析和鑒定方劑的固有成分，可以為進一步研究中藥藥效物質奠定良好的基礎[7]。Luo LQ 等[1]對補腎益氣湯分析結果表明，60%乙醇溶液體外提取效果最佳；采用高效液相色譜-電噴霧飛行時間質譜聯(lián)用（HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）法分析提取液化合物種類，結合動物模型體內細胞因子分泌，比較不同提取方式化合物種類以及動物模型體內炎性因子水平，得到共有的38 種化合物，對此進行研究可以進一步找到造成藥效反應和藥效差異的物質基礎。

1.2 體外譜效相關性研究

譜效相關性研究是指運用色譜和光譜手段綜合分析中藥體外提取物質譜。其特點是選擇特征指紋，聯(lián)系體內外實驗藥效學變化參數(shù)，并利用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法，將“譜”和“效”聯(lián)系起來，然后采集較穩(wěn)定的有標志意義的特征峰，用于單味藥質量控制和方劑藥效物質基礎研究[8-9]。例如采用紅細胞凝集活性探討板藍根抗病毒活性試驗中，板藍根HPLC指紋圖譜顯示2號和11號（保留時間分別為7.23、43.00 min）峰的相對峰面積較大，說明在這兩個峰處家兔紅細胞的凝集作用較強，可能為板藍根抗病毒活性的特征指紋峰[10]?？蓛?yōu)先選擇此特征峰用于板藍根的進一步藥效物質基礎研究和質量控制。

1.3 血清色譜法研究

血清色譜法可以排除機體對藥物代謝的影響，更深入地了解中藥的系統(tǒng)調節(jié)機制，鑒別和檢測血中移行成分（包括內源性和外源性生物活性物質）。探索這些化合物群的藥理作用和代謝規(guī)律，闡明疾病的發(fā)生、發(fā)展和藥物作用關系，將有助于我們快速準確地找出中藥藥效的基礎化合物群[11]。王喜軍等[12]采用血清藥物化學理論分析酸棗仁湯血中移行成分，對比小鼠用藥前后血清體外色譜，共發(fā)現(xiàn)9 個血中移行成分，并鑒定了其中7個移行成分，為進一步闡明各成分藥理作用提供了幫助。

1.4 藥效差示血清色譜法研究

文愛東等[13]首先提出藥效差示血清色譜法，并認為中藥在機體產生藥效變化時，機體血清藥物成分變化差中必定最小范圍而最大程度地包含真正的藥效物質。借助色譜法建立中藥對癥產生最大藥效和最小藥效時血清中有效化合物物質譜，然后以差示法表達并初步分離出該組方在體內的藥效物質基礎，并將分離產物用于對癥模型，以藥效驗證結果反饋性調整差示色譜條件，直至確認藥效物質。隨后，其以血清流變學中全血黏度為藥效指標，借助HPLC建立紅花提取物最大藥效和最小藥效時含藥血清指紋圖譜，得到紅花藥效基礎羥基紅花黃色素A，最大藥效時間為給藥后3 h[14]。該方法證實了紅花的藥效物質基礎，為進一步研究其他中藥及其方劑藥效物質基礎提供了新方法、新思路。

1.5 中藥拆方分析研究

中藥拆方分析研究是在中醫(yī)理論的指導下中藥研究的常用方法。通過此法分析體內外化合物種類、含量或藥效學指標的變化可實現(xiàn)以下幾個目的[15-16]：①確定方劑最佳組合和最佳配比關系，精簡方劑；②確定方劑中主要藥效物質基礎或化合物群；③詮釋中藥組方的合理性和科學性。王喜軍 等[12]檢測酸棗仁湯全方和各藥物缺味配伍時血中移行成分差異結果顯示，9種入血成分只有在方劑全方配伍時才能被機體選擇性吸收。劉欣等[17]對涼血活血膠囊進行拆方研究結果表明，全方組作用優(yōu)于各拆方組，尤其是抑制人外周血白血病T（Jurkat T）細胞活性和降低腫瘤壞死因子α（TNF-α）分泌的作用。

1.6 中藥蛋白質組學、代謝組學、基因組學研究

中藥蛋白質組學將其重點放在可能涉及到特定功能機制的蛋白質群上，研究實驗條件下蛋白質的表達情況，將成分復雜的中藥成分和蛋白質的表達、修飾相關聯(lián)，以表明中藥方劑多種有效化合物的多靶點綜合作用，揭示中藥方劑毒性、藥效物質基礎和作用機制[18]。類風濕性關節(jié)炎（RA）大鼠受損關節(jié)滑膜組織的一些蛋白表達水平發(fā)生改變，而當歸拈痛湯有明確的抑制RA滑膜病理改變作用，使肌球蛋白輕鏈2、白細胞介素1 受體和過氧化物酶等多種蛋白表達恢復正常，揭示其抗RA 的機制可能為：①抑制組織局部的炎癥反應信號通路；②保護細胞結構；③抑制氧化應激反應[19]。

中藥代謝組學通過方劑整體作用后代謝產物的一系列變化，能夠整體、系統(tǒng)、全面地反映機體病理生理變化，分析生物體血清、血漿、尿液等體液中代謝產物含量變化，有助于我們尋找有標志意義的藥效指標和毒性指標，進而闡明發(fā)病機制和中藥藥效物質基礎，特別適合于成分復雜的中藥研究[20-22]。例如，大黃成分最優(yōu)配比用于大鼠腦缺血再灌注，能調節(jié)血漿和尿液中代謝產物恢復正常[23]。Jun WX等[24]研究熊膽粉作為傳統(tǒng)中藥治療丙型肝炎的結果顯示，熊膽粉可使丙肝模型樹鼩體內代謝產物中38種小分子化合物水平發(fā)生變化，其中25種顯著上調，13 種明顯下調。以上提示這些化合物中必然包含了中藥方劑潛在的藥效指標，可用于表征疾病發(fā)展程度和藥物作用強弱，并進一步闡明藥物作用機制。

中藥基因組學是基于中藥和基因對人體的整體調節(jié)作用，深入到分子水平和基因水平，尋找中藥在基因組上的作用靶點、作用規(guī)律以及生物活性成分的片段基因，用于中藥藥效物質基礎的發(fā)掘和體外合成研究中[25]。例如四物湯（SWT）可以激活核轉錄因子E2 相關因子2（Nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）以及該因子調節(jié)的相關基因（HMOX1、SLC7A11）。另有研究表明，SWT對H2O2誘導的人正常乳腺細胞（MCF-10A）凋亡同樣有保護作用，并可使HMOX-1、SLC7A11 基因在小鼠肝臟和乳腺中表達呈劑量相關性上調[26]。

1.7 細胞膜親和色譜研究

細胞膜親和色譜是將HPLC 與細胞膜生物學和受體理論結合，利用細胞膜受體與藥物間存在的特殊親和力篩選中藥活性成分的方法。細胞膜上存在大量藥物作用靶點，只有能與細胞膜靶點結合的化學成分才有可能產生生物效應。該法具有色譜分離和細胞膜活性的雙重功效，可以對受體結合藥物實行定性定量分析，有利于中藥復雜混合物的篩選和分離[27]。朱建梁等[28]采用鼠腎小球系膜細胞作為固定相篩選丹皮中活性成分，排除未與細胞膜結合的非活性成分后，確定丹皮酚是丹皮中主要有效成分，可作為控制丹皮及其制劑的質量標準。

2 建立多元化中藥指紋圖譜庫的意義

中藥藥效物質研究過程同時也是各種檢測技術，尤其是色譜和光譜技術在該領域應用不斷深化、細化的過程。利用色譜和光譜技術建立中藥“指紋圖譜”已被廣泛應用于中藥注射劑和部分固體制劑的質量控制和含量測定，實現(xiàn)了對其制劑的質量和穩(wěn)定性的良好控制[29]。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質量控制手段，兼具整體性與模糊性的特點，適用于中藥質量控制[30]。指紋圖譜的建立過程一般由色譜圖獲取和相似度評價兩部分組成，相似度評價的最終目的是通過樣品色譜圖與對照品圖譜比較，判別樣品的真?zhèn)渭笆欠窈细?。即通過對具體化學成分物理結構進行表征，可以對方劑復雜體系所含化學成分進行比較直觀全面的描述，以表征該類混合物[31]。

化學藥品、抗生素和生物制品有其西藥標準，而傳統(tǒng)中藥成分復雜，每一種單體作用往往無法預知，各成分互相影響，我們應該建立相應的中藥標準[32]。利用質量嚴格控制、臨床作用明確的藥品，結合體外提純分析、血清藥物分析、細胞膜親和分析以及蛋白質、基因、代謝組學分析等多種手段進行圖譜分析，形成“多元化中藥指紋圖譜”，充分探究引起藥效和不良反應的藥效學基礎，尋找能夠代表中藥主要功效和不良反應的藥效學指標，使之成為指紋區(qū)相應的識別指標或特征峰[29]。劃定指紋圖譜波動范圍，制定有借鑒和標準意義的標準圖譜，建立中藥標準指紋圖譜庫，通過比對圖譜相似性，嚴格控制指定指標的浮動范圍，從而控制中藥質量[33]。

3 結語

中藥藥效物質基礎研究是一個系統(tǒng)工程，而傳統(tǒng)中藥也無疑是一個有待開發(fā)的寶庫。我們必須采取多學科交叉的方式，開拓思路，著眼方劑二次開發(fā)戰(zhàn)略，規(guī)范中藥市場，使中藥方劑成為我國擁有自主知識產權的又一個新興產業(yè)[34-35]。借鑒西藥發(fā)展過程中取得的優(yōu)秀成果，并將之運用到中藥之中，開發(fā)中藥新劑型，尋找適合中藥給藥的新途徑；利用現(xiàn)代工藝，如將中藥超微粉碎，加工成使用方便、易于攜帶的混懸劑、膠囊劑和滴丸劑等，或藥效可控的速釋、緩釋、控釋以及腸溶劑等，或結合新工藝制成微囊、包合物和固體分散體等，滿足不同病理條件的需求[36]。還可結合現(xiàn)代制劑工藝，實現(xiàn)對中藥的現(xiàn)代化改造和修飾，使藥物更加穩(wěn)定、藥理作用更強[37]。

中藥在臨床應用過程中，也要警惕類似西藥發(fā)展過程中所發(fā)生的藥物不良事件，以及做好應對不良事件的緊急處理措施[38]。相比西藥，中藥應更加注重不同藥物間的配伍問題，如單味藥之間、單味藥與“方”之間、“方”與“方”之間、不同劑型之間、“方”與西藥之間等，以到達增效減毒的效果[39]。中藥的用法用量以及所用方劑的種類應結合實際病情加以調整，在中醫(yī)辨證思想和中醫(yī)癥候分類的基礎上建立中藥臨床應用以及藥效學評價原則[32]。利用動物模型或相關參數(shù)較為準確地對病癥進行表征，適時變換劑量、種類和配伍，類比西藥對于疾病的控制手段，區(qū)分重癥控制階段、病情穩(wěn)定階段和康復鞏固階段，合理應用以提高療效、降低不良反應，這不僅是中藥方劑現(xiàn)代化和國際化的要求，也是臨床合理應用的關鍵[40]。

化學藥品和抗生素的研究已經到達一個相對的瓶頸階段，各國學者將會把目光投向有著巨大潛能的天然藥物，中藥必將在其中占據(jù)重要地位。我們雖擁有如此巨大的資源，而研究技術卻相對滯后，還沒有一個有效的研究體系，必將迎來巨大的競爭和挑戰(zhàn)。所以在未來的中藥發(fā)展中，我們首先要使中藥的生產、研究、流通和使用規(guī)范化，尤其是在藥效物質基礎研究領域，讓中藥研究標準成為未來天然藥物研究領域不可或缺的重要標準[41]。

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